寧夏四地區奶牛球蟲病流行病學調查及蟲種鑒定

牛曉昊 ， 黎玉瓊 ， 郭亞男 ， 王 鑫 ， 李繼東

(1.寧夏大學農學院 ， 寧夏 銀川 750021 ； 2.寧夏農林科學院動物科學研究所 ， 寧夏 銀川 750002)

牛球蟲病(Bovine coccidiosis)是艾美耳球蟲寄生于牛腸道上皮細胞引起的原蟲病，具有嚴格的宿主特異性[1-2]。球蟲寄生于腸上皮細胞可導致腸道嚴重損傷，出現不同程度的腹瀉，偶爾可見血便。牛感染艾美耳球蟲1周后，其腸黏膜就會被破壞，進而造成細菌繼發感染，此時體溫升高，前胃遲緩，腸蠕動增強，體液過度消耗。當轉化為慢性病后，牛可出現長期下痢、貧血、形體消瘦等現象，給養殖戶造成巨大的經濟損失。國內外均有牛球蟲病的報道。Koutny等[3]調查發現，奧地利在2010年的艾美耳球蟲感染率為83.67%，并發現了11種艾美耳球蟲，其中牛艾美耳球蟲為優勢蟲種。Tamrat等[4]對埃塞俄比亞西北部的奶牛球蟲調查結果顯示，球蟲感染是犢牛腹瀉的主要因素。患球蟲病的成年奶牛雖無明顯癥狀，但免疫力和飼料轉化率低，繼而引發其他疫病[4]。國內的報道顯示，北京、新疆、甘肅等都是奶牛球蟲病的高發地區[5-7]。因此，防治牛球蟲病是減少牛產業經濟損失不可或缺的環節。

近年來，寧夏回族自治區大力發展畜牧業，奶牛球蟲病也越來越被重視，但對該地區奶牛球蟲病流行狀況的了解還不夠全面。本試驗通過對寧夏四地區不同月齡的奶牛球蟲病進行調查，分析不同月齡奶牛艾美耳球蟲的球蟲種類、感染率和感染強度，以期為寧夏奶牛球蟲病的防治提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 顯微鏡(型號為OLYMPUS CX31)，購自上海富萊光學科技有限公司；計數板(型號為A3875)，購自上海富雪生物科技有限公司；膠頭滴管、網篩、離心機(型號為Centrifuge 5810 R)，均購自雷德生物技術有限公司；培養箱(型號為HF90)，購自上海力申科學儀器有限公司；電子天平(型號為JD500-2)，購自西杰天平(北京)儀器有限公司；載玻片、蓋玻片、燒杯、培養皿、氯化鈉、重鉻酸鉀，均購自上海廣諾化學科技有限公司；PBS緩沖液，購自金克隆(北京)生物科技有限公司。

1.2 樣品來源 按照每個月齡段奶牛總數的15%比例隨機采集樣本，共采集1 938份糞樣，通過直腸取樣或采集新鮮糞樣，隨后立即放入盛有冰袋的保溫箱里，并詳細記錄樣本采集牛的圈舍、牛號、月齡以及糞樣性狀。樣本帶回實驗室于4 ℃冰箱保存待檢。本調查涉及的14個牛場在6個月內均沒有使用過抗球蟲藥。

1.3 卵囊計數 通過麥克馬斯特法對球蟲卵囊進行計數。取2 g糞樣置于干凈的100 mL燒杯內，加入8 mL飽和食鹽溶液，用玻璃棒搗碎混勻。再加入50 mL飽和食鹽溶液，混勻后立即用60目篩網過濾。然后立即吸取濾液充滿2個計數室，在顯微鏡載物臺上靜置3～5 min，在10倍物鏡下鏡檢計數。每個計數室內有100個方格，其體積為1 cm×1 cm×0.15 cm=0.15 mL。分別查完2個計數室100個方格內的卵囊數量n1和n2，按照如下公式計算每克糞便中球蟲卵囊數(OPG)[8-9]。

OPG=[(n1+n2)/(2×0.15)]×60÷2

1.4 球蟲卵囊形態觀察 收集保存鏡檢球蟲卵囊呈陽性的糞樣每份20 g，將糞樣加入離心管內，加入適量水攪拌均勻。然后用40目和60目銅篩分別過濾，加PBS緩沖液3 500 r/min離心15 min，傾去上清液，重復1次。再加飽和食鹽水2 000 r/min離心10 min，此時糞渣沉于管底，卵囊漂浮于飽和食鹽水表面。移液槍吸取上清液注入含2.5%重鉻酸鉀溶液的培養皿中，保存于29 ℃的恒溫箱中每6 h鏡 檢觀察1次，待所有卵囊孢子化達到95%以上，得到孢子化卵囊，在400倍顯微鏡下觀察卵囊形態[10-12]。

1.5 統計分析 采用SAS 8.2統計分析軟件中的卡方檢驗，對寧夏不同地區的奶牛球蟲發病率進行差異性分析。

2 結果

2.1 寧夏四地區不同牛場球蟲的陽性率及感染強度 在寧夏四地區采集的1 938份新鮮糞樣中，共檢出856份為艾美耳球蟲陽性，平均感染率為44.17%。 各牛場均存在感染情況，其中奶牛球蟲病的最高陽性率為64.29%，最低陽性率為11.11%，最高平均OPG為5 776.32，最低平均OPG為283.58。每個牛場均存在混合感染，檢出艾美耳球蟲種類最多為12種，最少為2種。不同牛場奶牛艾美耳球蟲感染率無統計學意義(P>0.05)。在本次調查中，石嘴山市、銀川市、吳忠市和青銅峽市的奶牛球蟲陽性率分別為46.38%、46.36%、50.00%和27.71%，其中吳忠市的奶牛球蟲感染率最高，但平均OPG最大的是銀川市(5 776.32), 見表1。青銅峽市的陽性率與其他3個市的陽性率相比差異極顯著(P<0.01)。被檢測出的艾美耳球蟲種類分別有牛艾美耳球蟲、柱狀艾美耳球蟲、邱氏艾美耳球蟲、阿拉巴艾美耳球蟲、奧博艾美耳球蟲、巴西艾美耳球蟲、拔克朗艾美耳球蟲、加拿大艾美耳球蟲、橢圓艾美耳球蟲、皮利他艾美耳球蟲、亞球形艾美耳球蟲和懷俄明艾美耳球蟲，共12種艾美耳球蟲(見封底彩版圖1)，并檢出12 640個卵囊。

表1 寧夏四地區的不同牛場球蟲的陽性率及平均OPG

2.2 寧夏四地區的艾美耳球蟲感染種類及感染強度 本調查結果顯示，寧夏四地區牛艾美耳球蟲的感染率最高，為39.99%，是優勢蟲種，其次為柱狀艾美耳球蟲，感染率為20.17%，石嘴山市奶牛球蟲的優勢蟲種為牛艾美耳球蟲，銀川市奶牛球蟲的優勢蟲種為牛艾美耳球蟲，吳忠市奶牛球蟲的優勢蟲種為柱狀艾美耳球蟲，青銅峽市奶牛球蟲的優勢蟲種為亞球形艾美耳球蟲和牛艾美耳球蟲。

2.3 寧夏不同月齡奶牛的球蟲感染情況分析 各個月齡奶牛的球蟲感染率不同，隨月齡呈現增長趨勢，1月齡以內犢牛球蟲感染率最低，為11.32%，其中主要是大于21日齡的犢牛感染，小于21日齡的犢牛球蟲感染率為0；2～3月齡犢牛球蟲的平均感染強度最大，平均OPG為6 277.44；10～12月齡奶牛球蟲的陽性率最高，為62.07%，平均OPG為1 574.31，見表2。不同月齡奶牛球蟲的感染率統計學差異極顯著(P<0.01)。

表2 不同月齡奶牛球蟲感染情況

2.4 寧夏不同月齡奶牛感染艾美耳球蟲的種類變化情況分析 不同月齡奶牛感染艾美耳球蟲種類分析結果見圖2。1月齡以內犢牛主要感染牛艾美耳球蟲，2～3月齡犢牛主要感染柱狀艾美耳球蟲，4～6月齡 奶牛主要感染牛艾美耳球蟲和皮利他艾美耳球蟲，7～9月齡奶牛主要感染亞球形艾美耳球蟲和牛艾美耳球蟲，10～12月齡奶牛主要感染牛艾美耳球蟲和亞球形艾美耳球蟲。不同月齡奶牛的優勢蟲種也不一樣，牛艾美耳球蟲和邱氏艾美耳球蟲致病性最強，最容易危害犢牛。

圖2 寧夏四地區不同月齡奶牛感染艾美耳球蟲種類所占百分比

3 討論

近年來，奶牛球蟲病的發病率不斷上升，養殖戶對奶牛球蟲病也非常重視。張寬寬等[13]在2016年 對新疆7個地區18個規模化奶牛場球蟲病的流行調查顯示，球蟲總感染率為35.0%(487/1 391)， 7～12月齡奶牛球蟲感染率最高，為48.8%。蔣業慧等[14]調查新疆奎屯地區5個規模化奶牛場發現，其奶牛球蟲平均感染率為34.14%(99/290)，2～3月齡犢牛球蟲感染強度最大，平均OPG為14 456。金蘭梅等[15]在2008年對江蘇部分地區奶牛場采集糞樣的調查結果顯示，奶牛球蟲感染率為33.52%(704/2 100)，其中2～6月齡奶牛球蟲感染率最高，為50.00%，0～1月齡犢牛感染率最低，為12.38%。倪曉婷等[16]在2015年對寧夏奶牛球蟲病的調查發現，寧夏奶牛球蟲平均感染率為27.46%(117/426)。本調查發現，寧夏四地區奶牛球蟲的平均感染率為44.17%(856/1 938)，均高于我國已報道各地的奶牛球蟲病的調查結果。與倪曉婷等[16]的研究出現差異的原因可能與采集地區、奶牛場和樣本數量有關。這些調查報告結果進一步說明，奶牛球蟲病流行較普遍，以往長期添加抗球蟲藥，很大程度上掩蓋了球蟲病流行嚴重的事實，隨著國家限抗、禁抗政策的全面實施，尤其是離子載體抗生素在飼料中的禁用，使得奶牛球蟲的發病率出現激增現象，因此更加需要注意綜合防控。

本調查發現，球蟲感染普遍存在于寧夏各個牛場，四地區的不同牛場球蟲感染率也存在差異，這與牛場的管理理念有很大關系，如斷奶犢牛的管理以及環境衛生的要求等。其中1月齡以內犢牛的優勢蟲種為牛艾美耳球蟲，其致病性最強，對犢牛的危害也最嚴重。犢牛球蟲病的發病原因很多，斷奶應激和轉群應激都可能導致犢牛發病，其次就是犢牛飼養密度要合適，密度過大更易引起群體發病。本次通過對寧夏四地區的調查共發現12種艾美耳球蟲，其中牛艾美耳球蟲是寧夏部分地區的優勢蟲種。不同月齡的奶牛所感染的球蟲種類也不一樣，倪曉婷等[16]發現1～3月齡犢牛主要感染柱狀艾美耳球蟲、奧博艾美耳球蟲和橢圓艾美耳球蟲。本調查發現1～3月齡犢牛主要感染柱狀艾美耳球蟲、牛艾美耳球蟲和邱氏艾美耳球蟲。其中柱狀艾美耳球蟲的感染率最高，這與倪曉婷等[16]報道結果一致。在此次調查中發現，1～3月齡段的犢牛感染牛艾美耳球蟲和邱氏艾美耳球蟲的比例較高，這2種 艾美耳球蟲致病性最強，對犢牛危害最大。本調查還發現，4～6月齡奶牛主要感染牛艾美耳球蟲和皮利他艾美耳球蟲，7～9月齡奶牛主要感染亞球形艾美耳球蟲和牛艾美耳球蟲，10～12月齡奶牛主要感染牛艾美耳球蟲和亞球形艾美耳球蟲，10～12月齡 奶牛球蟲感染率最高，為62.07%，但是感染強度最大的是2～3月齡的犢牛，其平均OPG為6 277.44。成年奶牛對球蟲具有較強的抵抗力，很少發病，一般呈隱性感染狀態，可排出卵囊污染環境。蔣業慧等[14]在新疆奎屯地區的調查結果顯示，1～2歲奶牛球蟲的感染率最高，為39.72%，但2～3月齡犢牛的球蟲平均感染強度最大，OPG為14 456。 張寬寬等[13]在新疆的規模化奶牛場的調查結果顯示，7～12月齡奶牛的球蟲感染率最高，為48.8%，小于2月齡的犢牛的平均OPG最大，為2 667.1。 趙其平等[17]在上海地區奶牛球蟲的調查結果表明，0～2月齡犢牛的球蟲感染率最大，為61.9%。這些調查結果均與本調查結果一致。因此，對于規模化奶牛場，球蟲病主要危害1～3月齡犢牛，導致犢牛腹瀉、脫水、被毛粗糙，甚至導致犢牛出現血便以及死亡，大于1歲的奶牛球蟲感染率高，但感染強度低，大多都是球蟲攜帶者，已獲得自然免疫，但是奶牛會不斷排出卵囊，增加了牧場的環境污染。臨床型奶牛球蟲病的發生主要和艾美耳球蟲種類、攝入卵囊數量、感染奶牛月齡、繼發感染以及牛場管理措施等因素有密切關系。1～3月齡犢牛的球蟲感染率高，這與犢牛體質有關，犢牛出生后免疫功能不健全，抗病能力較差，瘤胃發育不完全，容易引起發病，成年奶牛身體的各項機能發育較完善，抵抗力較強。

總之，準確的診斷和流行病學調查是奶牛球蟲病綜合防治的關鍵環節。奶牛養殖場必須加強飼養管理，注重環境衛生；合理安排飼養密度，減少斷奶、轉群，分批進欄飼養；定期檢測，掌握抗球蟲藥持效期，綜合評估驅蟲效果。