A型塞內卡病毒VP1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

郭金碩 ， 侯 磊 ， 全 榮 ， 王 菁 ， 韋 莉 ， 劉 爵

(1.北京農學院動物科學技術學院 ， 北京 昌平 102206 ； 2.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所畜禽傳染病防控技術北京市重點實驗室 ， 北京 海淀 100097)

2016年，國際病毒分類學委員會將塞內卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)正式更名為A型塞內卡病毒(Senecavirus A,SVA)[1]，該病毒與豬水皰病(SVA-VD)和流行性暫時性新生仔豬死亡(Epidemic transient neonatal mortality,ETNL)相關[2]。2002年A型塞內卡病毒首次被發現[3]，早期研究認為該病毒是非致病性的，感染后的豬沒有明顯的臨床癥狀[4]。然而，2015年巴西等多國相繼發生塞內卡病毒感染豬的疫情[5-7]，感染豬口鼻部和蹄冠部出現原發性水皰和新生仔豬死亡率升高等現象[8]，同年我國廣東省發現第1例SVA感染[3,9]，之后在福建[10]、河南[11]、湖北[12]等地相繼檢測出SVA，對生豬產區造成了嚴重危害。

A型塞內卡病毒是無囊膜、單股、正鏈RNA病毒，是微RNA病毒科塞內卡病毒屬的唯一成員[13]，基因組大小為7.2 kb，具有單一的開放閱讀框(ORF)，能夠編碼2 181個氨基酸的多肽，經過水解和切割后其包括前導蛋白(L)、結構蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和非結構蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[3]。VP1蛋白具有良好的免疫原性，能夠刺激機體產生中和抗體，具有免疫優勢，且在SVA不同毒株中相對保守[2]，因此，VP1蛋白是塞內卡病毒免疫學診斷的重要靶標之一，并且在塞內卡病毒致病機制的研究中具有重要意義[14-15]。本研究利用SVAVP1(528 bp)片段制備出能夠穩定分泌抗SVA VP1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并利用SVA(CHhb17)對雜交瘤細胞株分泌產生的抗體進行Western blotting和間接免疫熒光鑒定，該單克隆抗體的制備為A型塞內卡病毒診斷方法的建立與致病機制的研究提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物、質粒和病毒 BHK-21細胞，購自美國細胞菌種庫(ATCC CRL-1650)。SP2/0骨髓雜交瘤細胞、表達載體pET30a-GST由本實驗室保存。6周齡雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。A型塞內卡病毒毒株CHhb17由本實驗室保存。

1.2 試劑BamH I、XhoI，均購自寶生物工程(大連)有限公司。DNA Ligation Kit Ver 2.0,購自TaKaRa公司。NBCS新生胎牛血清、FBS胎牛血清、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG，均購自Thermo-Fisher Scientific公司。IPTG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、單抗亞型鑒定試劑盒、異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗小鼠IgG、HAT選擇性培養基，均購自Sigma公司。RNeasy?Mini Kit、DNA片段膠回收試劑盒，均購自QIAGEN公司。TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，購自北京全式金生物技術有限公司。Ni2+親和層析柱，購自GE公司。

1.3 引物的設計、合成 參考A型塞內卡病毒毒株CHhb17的VP1基因序列(GenBank登錄號：MG983756.1)，設計特異性引物，委托中美泰和有限公司合成，在構建原核表達重組質粒的過程中選取BamH I和XhoI為限制性核酸內切酶，引物設計如下：VP1-F(528 bp)：CTCTGGATCCTCCACCGACAACGCCGAG(下劃線處為BamH I);VP1-R(528 bp)：GGTGCTCGAGTCCACCCTTGCTGGTGAA(下劃線處為XhoI)。

1.4 原核表達載體的構建與鑒定 提取A型塞內卡病毒毒株CHhb17 RNA，并測定RNA濃度，并將其反轉錄為cDNA，采用PCR技術擴增SVAVP1(528 bp)基因，反應體系20 μL：1 μL模板、2 μL dNTPs、10 μL Buffer、1 μLVP1-F、1 μLVP1-R、0.5 μL聚合酶、4.5 μL ddH2O。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，使用膠回收試劑盒純化目的片段。SVAVP1(528 bp)基因片段與原核表達載體pET30a-GST分別用BamH I、XhoI雙酶切，純化回收目的基因片段，將1 μL載體(pET30a-GST)，5 μL酶切回收產物，4 μL連接酶混合物混勻，室溫反應30 min以上。重組質粒轉化BL21感受態細胞，選擇氨芐青霉素抗性的LB涂板，晾干，倒置37 ℃培養箱過夜，挑取菌落用VP1-F、VP1-R引物進行PCR檢測，陽性菌進行基因測序。

1.5 VP1蛋白誘導表達與純化 將測序正確的pET30a-GST-VP1(528 bp)菌株，接種到1 L氨芐青霉素抗性的LB液體培養基中，200 r/min，37 ℃培養。待菌液培養至OD=0.6～0.8，加入濃度為0.5 mmol/L的IPTG中，37 ℃誘導4 h。誘導后離心收菌，超聲破碎，再次離心后分別取上清和沉淀，通過12% SDS-PAGE電泳，確定重組蛋白的表達形式。使用Ni2+親和層析法對重組蛋白進行純化，為了確定最佳洗脫濃度，采用15、60 mmol/L和500 mmol/L濃度的咪唑進行洗脫，收集流穿液與洗脫液。將制備的樣品進行12% SDS-PAGE電泳鑒定，然后將純化的蛋白作為抗原免疫小鼠，剩余的置于-80 ℃保存備用。

1.6 小鼠免疫與細胞融合 純化后的重組蛋白按照1∶1的比例與弗氏完全佐劑充分乳化，初次免疫4只 6周齡雌性 BALB/c小鼠，背部皮下多點注射，每只免疫30 μg，二免和三免使用弗氏不完全佐劑與重組蛋白以1∶1的比例充分乳化，采用相同的免疫方法，免疫間隔為3周，三免14 d后采血，進行免疫效價檢測，小鼠編號為1、2、3、4，將純化的重組蛋白進行ELISA檢測，當小鼠血清OD450 nm/陰性對照OD450 nm>2.1，判定為陽性，采用聚乙二醇(PEG)法對血清效價較高的小鼠脾細胞與SP2/0細胞進行融合，融合細胞用半固體培養基(含HAT)進行篩選培養，通過間接ELISA的方法篩選出陽性細胞孔，按照有限稀釋法進行連續3次亞克隆純化，直至雜交瘤細胞陽性率達到100%且為單個克隆，從而獲得能夠穩定分泌抗SVA VP1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，最后通過單抗亞型鑒定試劑盒進行亞型鑒定。

1.7 腹水制備與純化 以0.5 mL/只石蠟油腹腔注射6周齡雌性BALB/c小鼠，10 d以后用同樣的方法腹腔注射陽性雜交瘤細胞，7～10 d后采集小鼠腹水，離心后取上清，經過辛酸-硫酸銨法和Protein G柱對抗體進行純化，純化后的單抗樣品用12% SDS-PAGE電泳鑒定。

1.8 單克隆抗體的特異性鑒定 Western blotting檢測:使用含有10% FBS的DMEM培養基在6孔板中培養單層BHK-21細胞，棄去培養基，SVA感染細胞1 h，換用含有2% FBS的DMEM維持培養基培養細胞，陰性對照為含有2% FBS的DMEM維持培養基培養的單層BHK-21細胞，培養24 h，裂解細胞制備蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳與轉膜，最后進行顯影以及圖像采集。

1.9 間接免疫熒光檢測 在24孔板中使用10% FBS的DMEM培養單層的BHK-21細胞，待長至90%以上，棄去培養基，SVA感染細胞1 h，棄掉培養基，使用含有2% FBS的DMEM維持培養基培養細胞，陰性對照為含有2% FBS的DMEM維持培養基培養的單層BHK-21細胞。病毒感染24 h后無水乙醇固定30 min，PBST洗3次，5 min/次，加入抗SVA VP1單克隆抗體，37 ℃孵育2 h，PBST洗3次，5 min/次，然后加入抗小鼠IgG-FITC標記抗體(1∶50倍稀釋)，37 ℃避光孵育2 h，PBST洗3次，5 min/次，封片鏡檢，觀察結果。

2 結果

2.1 pET30a-GST-VP1(528 bp)重組質粒的構建 以SVA RNA反轉錄的cDNA為模板，用VP1-R/VP1-F引物通過PCR的方法擴增SVAVP1 (528 bp)基因，將擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在500 bp左右出現1條特異性條帶，與預期SVAVP1 (528 bp)基因大小相近(圖1)。

圖1 VP1基因(528 bp)PCR擴增產物

2.2 重組SVA VP1蛋白的誘導表達 將擴增的SVAVP1 (528 bp)基因構建到原核表達載體pET30a-GST上，重組pET30a-GST-VP1 (528 bp)質粒轉化大腸埃希菌BL21感受態細胞，經過IPTG大量誘導表達重組蛋白，最后通過12% SDS-PAGE檢測蛋白表達情況，結果顯示：重組蛋白主要在沉淀中，以包涵體的形式存在，大小約為47 kDa，與預期蛋白大小一致(圖2A)。將其尿素溶解后透析復性，經鎳柱純化，使用不同濃度的咪唑進行梯度洗脫，最后進行12% SDS-PAGE電泳分析，結果顯示，本研究得到了純化的重組蛋白(圖2B)。

圖2 VP1重組蛋白的12% SDS-PAGE分析

2.3 單克隆抗體的制備 將純化的VP1重組蛋白乳化后免疫BALB/c小鼠，經過3次免疫后，測量小鼠血清效價。經檢測1號小鼠的血清效價最高，約為5×104。取1號小鼠脾細胞與SP2/0細胞通過PEG方法進行細胞融合，融合以后用含HAT半固體培養基進行篩選培養，經過間接ELISA方法進行3輪亞克隆篩選，得到1株能分泌抗VP1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，將篩選出的單抗進行亞型鑒定，結果顯示其重鏈亞型為IgG2a，輕鏈為Kappa鏈(表1)。

表1 抗SVA VP1單克隆抗體亞型鑒定

2.4 單克隆抗體的純化 收集制備的小鼠腹水，通過辛酸-飽和硫酸銨法與Protein G柱純化單克隆抗體，經12% SDS-PAGE電泳分析，在55 kDa和26 kDa出現2條清晰的條帶，與IgG重鏈和輕鏈的大小相符，結果顯示得到了純化的單克隆抗體(圖3)。

圖3 純化的VP1單抗的SDS-PAGE分析

2.5 單克隆抗體的鑒定 Western blotting檢測結果如圖4A所示，在29 kDa處出現明顯的條帶，與病毒編碼的SVA VP1蛋白大小相符，說明該單抗能夠與SVA編碼的VP1蛋白結合。間接免疫熒光鑒定結果如圖4B所示，病毒感染細胞后，單克隆抗體可以使感染病毒的細胞產生特異性熒光，且與正常的BHK-21細胞無反應，證明該單克隆抗體能識別SVA病毒粒子。

圖4 VP1單克隆抗體的鑒定

3 討論

SVA感染后的臨床癥狀主要為肌肉無力、嗜睡、跛行、厭食、鼻部和蹄部冠狀帶出現水泡甚至潰瘍[16-18]，新生仔豬發病率高達70%，死亡率介于15%～30%，并伴有腹瀉癥狀[19]，與其他水泡病病毒，如口蹄疫病毒(FMDV)、豬水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、豬水泡性皰疹病毒(VESV)的感染難以區分，需要進行鑒別診斷，因此發展SVA血清學檢測手段尤為重要，而單克隆抗體具有純度高、穩定性強、特異性強和易于標準化生產的優點，可以廣泛應用于A型塞內卡病毒各個方面的研究。

在微RNA病毒科中VP1蛋白普遍具有良好免疫原性，例如FMDV的VP1蛋白[20-21]，并且經常被用作候選疫苗研究的目標蛋白[22]。SVA VP1蛋白的氨基酸序列在所報道的SVA毒株中高度保守，相似性為95.8%～100%，而與其他微RNA病毒科的其他成員相似性小于30%(例如心臟病毒)，易與其他微RNA病毒區分開，且SVA VP1蛋白能夠刺激機體產生中和抗體[2]，因此本研究選擇VP1蛋白用于制備SVA的單克隆抗體。與真核表達系統相比，原核表達系統具有翻譯后修飾的缺陷，例如構象結構缺失、甲基化修飾缺失等，但優點是菌株生長快，易于操作和蛋白質生產量大[23]，因此本研究通過大腸埃希菌大量表達了SVA VP1蛋白。但是在本研究中，構建原核表達重組質粒時全長基因不能很好的表達SVA VP1蛋白，通過生物信息軟件分析，SVAVP1 148～675 bp 區域具備抗原性、親水性基因優勢，因此將VP1基因截短，即截取全長的528 bp，去除存在疏水區的基因序列，成功表達SVA VP1蛋白。載體中連接GST基因，構建的重組蛋白中包含GST蛋白，研究制備的單克隆抗體有可能針對GST蛋白，但在單克隆抗體的鑒定時，病毒編碼的VP1蛋白可以與單克隆抗體結合，因此該抗體具備識別的特異性，不與GST蛋白結合。另外本研究通過氨基酸序列比對，SVAVP1 (528 bp)與FMDVVP1氨基酸序列同源性為14.2%，SVAVP1(528 bp)與SVDVVP1氨基酸序列同源性為11.4%，表明SVAVP1序列與另外2個病毒的VP1同源性較低，抗SVA VP1單克隆抗體與另外2個病毒VP1反應性較低。

本研究利用大腸埃希菌原核表達系統獲得高純度的SVA VP1蛋白，通過小鼠免疫，細胞融合制備出SVA VP1單抗，該單抗可用于Western blotting和間接免疫熒光檢測，能夠與SVA感染的BHK-21細胞發生特異性反應，且不與未感染的BHK-21細胞發生反應，具有良好的反應性和特異性，為深入研究SVA VP1蛋白的結構、功能以及A型塞內卡病毒的鑒別診斷、致病機制的研究提供技術儲備。