10種消毒劑對非洲豬瘟病毒的滅活效果

程 晶 ， 許 健 ， 劉文曉 , 江 波 ， 李永清

(1. 北京市農林科學院畜牧獸醫研究所 ， 北京 海淀 100097 ； 2. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 ， 甘肅 蘭州 730046)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種急性、烈性傳染病。ASFV 感染家豬和野豬后，死亡率極高，可達100%，是我國目前養豬業主要的傳染病[1]。由于目前對于該病尚無有效的疫苗和治療藥物，因此建立良好的生物安全體系是切斷該病傳播的最有效措施，而實施全面徹底的消毒又是生物安全體系中的關鍵環節。ASFV為具有雙層膜結構的200 nm的大型囊膜病毒，基因組為170～193 kb的雙鏈DNA。病毒粒子呈現復雜多層的二十面體結構，整體由內向外依次是病毒基因組、核殼、內膜、衣殼和外膜。正是由于其結構的復雜性，ASFV對外界環境有更強而廣泛的耐受性。ASFV在低溫保持高度穩定[2]，在冷藏條件下，血液中存在的病毒可以存活18個月，在冷凍肉中可存活1 000 d以上[3]，加熱至56 ℃ 可70 min滅活，60 ℃滅活需要20 min；ASFV具有強耐酸堿性[4]，可耐受酸堿性范圍從pH<3.9至pH>13，血清可增加病毒的抵抗力，例如在pH為13.4時，無血清抗性持續長達21 h，而有血清則持續7 d。世界動物衛生組織(World Organization for Animal Health,OIE)手冊指出ASFV對一些消毒劑敏感[5]，如用8%氫氧化鈉(NaOH)作用30 min，3%福爾馬林作用30 min，或3%正苯基苯酚作用30 min等均能使病毒滅活，但目前市面上消毒劑品種眾多，各消毒制劑在臨床上對ASFV的滅活效果表現參差不一，因此比較分析不同消毒劑對ASFV的滅活效果，對在養殖過程中防控ASFV傳播和感染具有重要意義。

基于此，本試驗采用細胞感染試驗檢測10種消毒劑對ASFV的滅活效果。基于比較分析結果，進一步選擇了3種消毒劑對曾經暴發非洲豬瘟的廢棄豬場進行了環境消毒驗證，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病毒 中國非洲豬瘟病毒分離株ASFV SY18ΔMGF/ΔCD2v株[6](病毒含量107.5TCID50/mL)，該病毒感染豬原代肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)后表達綠色熒光蛋白，由中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所提供。

1.2 細胞 PAM取自1月齡經檢測ASFV抗原和抗體陰性的臨床健康豬的新鮮豬肺。用止血鉗夾住豬喉部下方，用線繩結扎與心臟相連的血管；采用滅菌的生理鹽水或PBS沖洗肺外側雜物，移至生物安全柜中；用酒精棉球消毒喉頭部分，向肺內灌入PBS，直至肺葉全部隆起；止血鉗結扎喉管，輕揉肺表面5 min，無菌收集灌洗液。反復4次后，用細胞濾器過濾全部的灌洗液，分裝離心管后1 000 r/min離心5～10 min，將收取的肺泡巨噬細胞計數。將細胞稀釋至2×106個細胞/mL。

1.3 消毒劑 本試驗所用消毒劑為由北京首農畜牧發展有限公司提供的商品化消毒劑，主要成分和配制方法見表1。

表1 所用消毒劑的主要成分和配制方法

1.4 試劑和耗材 細胞培養用DMEM和胎牛血清，均購自Gibco公司；Cell Counting Kit-8，購自北京安必奇生物科技有限公司；ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒，購自百沃特(天津)生物技術有限公司。

1.5 病毒滴度的測定 將PAM以2×106個/孔接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。將病毒液與細胞培養液按1∶10比例稀釋混合后，做8個稀釋度(10-3～10-10)，取100 μL各稀釋液接種到8個細胞孔中。37 ℃、5%CO2培養72 h后，在熒光顯微鏡下觀察并計算有熒光的細胞孔數，根據Reed-Muench法測定TCID50/mL的數值。本試驗在中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所BSL-3實驗室進行。

1.6 消毒劑稀釋液對細胞狀態的影響 將10種消毒液用含5%胎牛血清的DMEM細胞培養基按照200、400、800、1 600倍和3 200倍稀釋。待96孔板中細胞長至單層時棄去培養基，加入100 μL含有稀釋消毒劑的培養液，每個稀釋度設置5個重復孔，同時設置不加消毒劑的陰性細胞孔。37 ℃孵育1 h，棄細胞上清液，更換新培養液。37 ℃孵育8 h，在光鏡下觀察細胞狀態。利用CCK-8細胞增殖-毒性試劑盒檢測并計算消毒劑處理后的細胞活性，以篩選出對細胞安全的消毒液濃度。細胞活性計算公式：

細胞活性(%)=[A1-A0]/[A2-A0]×100%

式中A1為含消毒劑和CCK8溶液的細胞孔吸光度值，A2為不含消毒劑、含CCK8溶液的陰性細胞孔吸光度值，A0為含CCK8溶液和DMEM培養液、而不含細胞的空白孔吸光度值。用酶標儀在450 nm波長處測定各孔光吸收值，可間接反映活細胞數量。判定標準：“0”表示細胞活性<10%；“1”表示細胞活性≥10%且<20%，“2”表示細胞活性≥20%且<40%；“3”表示細胞活性≥40%且<60%；“4”表示細胞活性≥60%且<80%；“5”表示細胞活性≥80%。

1.7 消毒劑滅活ASFV效果檢測 將10種消毒液用細胞培養基先按照160、320、640倍和1 280倍稀釋，各取80 μL稀釋消毒液至96孔板，分別加入20 μL病毒液，消毒劑終濃度達到1∶200 ～ 1∶1 600，同時設置80 μL細胞培養液加20 μL病毒液作為陽性對照，并設立不加病毒液僅加100 μL細胞培養液的陰性對照，相同條件設2個重復孔?；旌暇鶆?，反應條件設室溫靜置0.5 h和2 h。反應結束，取各個消毒劑和病毒混合液加入含單層細胞的96孔板中，每孔100 μL。37℃孵育1 h后，棄細胞上清液，更換新培養液。37 ℃孵育72 h后，在熒光顯微鏡下觀察結果。若消毒液在終濃度1 600倍對細胞有損傷，則繼續取80 μL稀釋至1 600、3 200倍和6 400倍，分別加入20 μL病毒液，消毒劑終濃度達到1∶2 000、 1∶4 000和1∶8 000，混合均勻，室溫靜置0.5 h 和2 h，重復上述操作檢測消毒劑殺滅ASFV的效果。結果判定標準：有熒光信號，說明該稀釋度的消毒劑不能將病毒全部殺死；無熒光信號，說明該稀釋度的消毒劑可將病毒全部殺死。

1.8 消毒劑對豬場環境的消毒效果 根據上述消毒劑篩選結果，選取過硫酸氫鉀復合物、戊二醛和次氯酸這3種消毒劑，按照其使用說明書進行稀釋，在北京地區某豬場進行圈舍和場地消毒，1 h后分別采集畜欄、墻壁和場地等不同地點的樣品，帶回實驗室后用ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒進行檢測。判定標準：樣品Ct值≤38并出現特定的擴增曲線，且陰性、陽性對照成立(陽性對照Ct值≤38并出現特定的擴增曲線，陰性對照無Ct值并無特定擴增曲線)，則判定為陽性。

2 結果

2.1 消毒劑對細胞狀態的影響 不同濃度消毒劑對細胞狀態的影響不同。加入消毒劑1 h后換液繼續培養，過硫酸氫鉀復合物、二氯異氰脲酸鈉、次氯酸、苯扎溴銨、聚酮維碘的最低稀釋度(1∶200)對細胞狀態幾乎無影響。戊二醛、復方戊二醛、雙癸基二甲基氯化銨、碘酸混合溶液、戊二醛癸甲氯銨則對細胞狀態的影響比較大，在低于400倍稀釋時，無存活細胞，在800～1 600倍稀釋時對細胞也產生不同程度的損害，但在3 200倍稀釋時對細胞損害較小，結果見表2。

表2 不同稀釋度消毒劑對細胞狀態的影響

2.2 消毒劑在細胞上滅活ASFV效果檢測 結果如表3所示，過硫酸氫鉀復合物在200倍稀釋，室溫作用時間≥0.5 h，可完全滅活ASFV；二氯異氰脲酸鈉和苯扎溴銨，稀釋到800倍，室溫作用≥0.5 h，可完全滅活ASFV；苯扎溴銨稀釋到1 600倍時，室溫作用2 h可完全滅活ASFV，室溫作用0.5 h，不能完全滅活ASFV；聚酮維碘稀釋到1 600倍，室溫作用≥0.5 h，可完全滅活ASFV。由于戊二醛、復方戊二醛、雙癸基二甲基氯化銨、碘酸混合溶液、戊二醛癸甲氯銨在稀釋度低于1 600倍時對細胞活性影響較大，故稀釋度低于1 600倍時，無法判斷其對ASFV的滅活活性。次氯酸在最低稀釋倍數200倍時，室溫作用時間≥2 h，都無法滅活ASFV。

戊二醛、復方戊二醛、雙癸基二甲基氯化銨和戊二醛癸甲氯銨在1 600倍稀釋時對細胞活性有影響，稀釋至3 200倍以上時對細胞狀態影響較小。上述消毒劑在細胞安全劑量范圍的稀釋度內(4 000～8 000倍 稀釋)可有效滅活ASFV，滅活病毒能力較強。雖然在8 000倍稀釋比例下，碘酸混合溶液處理仍有ASFV病毒粒子的存在，然而，在4 000倍細胞安全劑量的處理下能有效滅活ASFV，這表明碘酸混合溶液也具有滅活ASFV的能力，見表3。

表3 不同稀釋度消毒劑室溫作用0.5 h和2 h對ASFV的影響

2.3 3種消毒劑對豬場環境的消毒效果 選取體外細胞試驗表明滅活效果好、中、差的過硫酸鉀復合物、戊二醛和次氯酸3種消毒劑，在北京地區某曾經暴發過非洲豬瘟的廢棄豬場進行圈舍和場地消毒1h后，分別采集地面畜欄、墻壁和場地等不同地點的樣品，以ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒進行檢測，結果如表4所示，過硫酸鉀復合物和戊二醛能夠有效滅活ASFV，消毒后Ct值均大于38，且無特征性擴增曲線，次氯酸消毒后的畜欄和場地樣品的Ct值為12.55和14.56，且出現特征性擴增曲線，這表明過硫酸鉀復合物和戊二醛消毒后的環境中的樣品無ASFV核酸的檢出，但次氯酸未能滅活ASFV，消毒后的環境樣品仍有ASFV核酸的檢出。

表4 熒光定量PCR檢測3種消毒劑對豬場環境消毒效果

3 討論

ASFV是一種對宿主豬感染力極強、傳播性極高的病毒。該病毒自2018年傳入我國以來，給我國養豬業造成巨大損失和極度恐慌。由于目前尚無疫苗等防控技術手段，嚴格而合理的生物安全防控成為保障豬場發展的最可靠屏障[7]。在所有的生物安全操作過程中，對養殖環境采用消毒劑進行消毒是最為核心的手段，而正確選擇和使用消毒劑是消毒有效的重要前提。由于當前我國市場上消毒劑品種繁多，難以選擇對ASFV滅活效果最佳的產品，因此本試驗挑選了10種普遍使用的消毒劑，首先在豬肺巨噬細胞上進行了ASFV的體外滅活試驗。結果發現，過硫酸氫鉀復合物、二氯異氰脲酸鈉、苯扎溴銨和聚酮維碘對肺泡巨噬細胞的影響較小，在較低濃度的稀釋比例下可有效滅活豬肺泡巨噬細胞中的ASFV；戊二醛、復方戊二醛、雙癸基二甲基氯化銨、碘酸混合溶液、戊二醛癸甲氯銨對豬肺泡巨噬細胞的影響較大，但在細胞安全劑量的情況下，依然能夠有效滅活肺泡巨噬細胞中的ASFV。然而，次氯酸在細胞的安全濃度下不具有滅活ASFV的作用。

體外評價消毒劑滅活ASFV的效果可采用懸液定量法，通過測定加入消毒劑前后病毒含量的變化，來判定消毒劑的滅活效果[7]。測定ASFV病毒含量的方法通常有紅細胞吸附試驗和間接免疫熒光(IFA)[8]。紅細胞吸附試驗需要制備新鮮SPF豬的紅細胞，并且不同批次的紅細胞吸附能力不同，甚至有些毒株不具有紅細胞吸附能力；IFA測定病毒滴度耗時長，加之需要抗體等昂貴試劑，加大了檢測的成本。本試驗采用的ASFV SY18ΔMGF/ΔCD2v株由于缺少了相應的毒力基因，因此生物安全風險大為降低，且其感染PAM后表達綠色熒光蛋白，因此可直接通過熒光顯微鏡觀察熒光信號來判讀結果，具有高效、快速和經濟等優點。

消毒劑對病毒的體外滅活效果通常是在實驗室理想狀態條件下進行的，但在臨床實際消毒實施過程中，消毒劑的使用效果可能會出現偏差，其原因可能是有機物的存在抵消了消毒劑的作用[9]，即血液、糞便等有機物存在的條件下，病毒更穩定、存活時間更長；豬欄和畜舍的漏縫地板、水泥底面和飼槽等各種設施經過多次使用后，在其表面會形成由糞便、灰塵和細菌組成的生物膜，會阻礙消毒劑有效成分與病原微生物的接觸；環境中存在降低消毒劑的濃度或改變消毒劑pH等因素。為此，本試驗基于細胞體外試驗的結果，挑選了3種正規上市的商品化消毒劑，根據其使用說明書對北京地區某曾經暴發過非洲豬瘟的廢棄豬場進行圈舍和場地消毒1h后，分別采集畜欄、墻壁和場地等不同地點的樣品，使用ASFV熒光定量PCR檢測試劑盒檢測ASFV核酸，結果顯示過硫酸氫鉀復合物、戊二醛對環境中的ASFV核酸具有較好的清除作用，但次氯酸未能降低豬圈內殘留的病毒核酸，甚至可能有具有活性的病毒存在，從而證實了本試驗中細胞體外試驗結果的可靠性。需要指出的是：很多人認為，消毒劑在環境中滅活病毒后，檢測病毒核酸意義不大。這種觀點對酒精等僅破壞病毒囊膜的消毒劑是合理的，但強氧化物等消毒劑可以使病毒核酸發生氧化還原反應，火堿等堿性消毒劑可以使病毒核酸發生中和反應，破壞病毒的核酸結構和性質，所以這些消毒劑對豬場進行消毒不僅能夠滅活病毒，更重要的是可以降解和清除病毒核酸，因而利用熒光定量PCR方法檢測病毒核酸來評價消毒劑的使用效果是可行的[10]。建議養殖場多考慮使用過硫酸氫鉀復合物、二氯異氰脲酸鈉、戊二醛、苯扎溴銨和聚酮維碘等消毒劑防控ASFV的感染。