多殺菌素固體緩釋劑的制備及對(duì)白紋伊蚊的防治效果

王 鴻 ， 于泓瀟 ， 張嶼萌 ， 張雅琪 ， 鄧景月 ， 趙建國(guó) ， 韓 謙

(1. 海南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ， 海南 海口 570228 ； 2. 海南大學(xué)全健康研究院 ， 海南 海口 570228 ; 3. 海南大學(xué)藥學(xué)院 ， 海南 海口 570228)

多殺菌素(Spinosad)是在刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)發(fā)酵液中提取的一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，經(jīng)過(guò)近年的發(fā)展已經(jīng)成為國(guó)際公認(rèn)的新型無(wú)害殺蟲劑[1]。多殺菌素在土壤中的光解半衰期為9～10 d，在水中的光解半衰期少于1 d，具有光解速度快、環(huán)境持久性風(fēng)險(xiǎn)低的特點(diǎn)[2]。白紋伊蚊(Aedesalbopictus)屬于“半家蚊”，多滋生于居民點(diǎn)及其周圍的各種人工積水容器中,是傳播登革熱的重要媒介[3]。目前就蚊幼的控制而言，基于蘇云金桿菌以色列變種、球形芽孢桿菌和刺糖多孢菌的微生物殺蟲劑受到了廣泛的重視[4-5]。蚊蟲的許多行為(如吸血、產(chǎn)卵和宿主搜尋等)主要受宿主動(dòng)物氣味物質(zhì)的影響。如人體對(duì)蚊蟲引誘的差異與人體汗液有關(guān)，而脂肪酸銨類物質(zhì)是人體汗液的主要成分，已被證實(shí)參與影響蚊蟲宿主搜尋行為[6]。均一體緩釋劑指在一定溫度下，將原藥均勻分散在高分子聚合物中，使兩者混為一體，形成固溶體、分散體或凝膠體，然后按需加工成固體形態(tài)的緩釋劑型[7-8]。本試驗(yàn)利用十六醇、聚乙二醇和碳酸銨等材料采用物理包埋的方法搭建骨架層-緩釋層制成一種具有殺滅與引誘作用的緩釋塊并測(cè)定其緩釋性質(zhì)，運(yùn)用生物測(cè)定的方法測(cè)試其對(duì)白紋伊蚊幼蟲的殺滅效果以及對(duì)成蟲的誘卵效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99%，上海瑪雅試劑有限公司)；聚乙二醇-1000、十六醇(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)；碳酸銨(分析純，西隴科學(xué)有限公司)；二氯甲烷、甲醇、乙腈(色譜純，上海麥克林生化科技有限公司)。

1.2 主要儀器 高效液相色譜儀(LC-20ADXR，日本島津公司)；恒溫磁力攪拌儀(GL-3250A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；氮吹儀(HSC-12B，天津恒奧科技有限公司)；超聲波清洗儀(PS-40，深圳市超藝達(dá)科技有限公司)。

1.3 蚊蟲飼養(yǎng) 白紋伊蚊由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病所提供。飼養(yǎng)條件為:溫度(26±1) ℃、相對(duì)濕度60%～70%、光周期12 L∶12 D(光照∶黑暗)。

1.4 多殺菌素緩釋劑的制備 將聚乙二醇-1000與十六醇按2.0 g ∶1.5 g比例置于80 ℃中恒溫均勻攪拌形成骨架-緩釋層，使用恒溫磁力攪拌器攪拌冷卻至60 ℃后，加入多殺菌素原藥攪拌混勻，冷卻至50 ℃后迅速倒模并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按上述條件分別制成加入0.05 g和0.02 g多殺菌素原藥的成品(用Spi-Block1和Spi-Block2表示)，以不含多殺菌素(用Block表示)為對(duì)照。

1.5 高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定緩釋濃度

1.5.1 色譜條件[9]色譜柱:島津C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相:甲醇—乙腈—水(40∶40∶20)，使用前經(jīng)超聲混勻備用；體積流量:0.8 mL /min；檢測(cè)波長(zhǎng):246 nm；柱溫:25 ℃；進(jìn)樣量:10 μL。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取多殺菌素0.01 g標(biāo)準(zhǔn)品，精確到0.000 1 g，用甲醇配成 1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用甲醇逐級(jí)稀釋為5、20、40、80 μg/mL和100 μg/mL 的梯度濃度溶液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC檢測(cè)，用峰面積W對(duì)濃度C(mg/mL)作線性回歸，得到回歸方程y=85.713x+26.544，R2= 0.999 8，成良好線性關(guān)系。

1.5.3 樣品緩釋濃度的測(cè)定 稱取0.25 g Spi-Block1于生測(cè)杯中,加入500 mL純水，分別取1、3、5、7 d和9 d的緩釋液1 mL，同時(shí)加入0.5 mL二氯甲烷超聲10 min，用氮?dú)獯蹈珊蠹尤? mL甲醇復(fù)溶，以等量多殺菌素原藥作為對(duì)照，二者均設(shè)3個(gè)重復(fù)，用1.5.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用1.5.2繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出9 d緩釋濃度。

1.6 多殺菌素緩釋劑的快速滅蚊效果測(cè)試 選擇聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)推薦的幼蟲浸漬法[10]來(lái)測(cè)試Spi-Block的速殺效果，在生測(cè)杯中加入25條3～4齡期的白紋伊蚊幼蟲和100 mL去氯水，試驗(yàn)組加入Spi-Block1、Spi-Block2；對(duì)照組加入質(zhì)量相同的Block；空白對(duì)照組不作處理(25條幼蟲+100 mL去氯水)，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，24 h內(nèi)每隔3 h測(cè)定1次，記錄活幼蟲數(shù)目。

1.7 多殺菌素緩釋劑的長(zhǎng)效滅蚊效果測(cè)試 在生測(cè)杯中加入25條3～4齡期的白紋伊蚊幼蟲和100 mL 去氯水，試驗(yàn)組加入Spi-Block1和Spi-Block2；對(duì)照組加入0.05 g純多殺菌素，空白對(duì)照組不作處理(25條幼蟲+100 mL去氯水)，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每周進(jìn)行1次幼蟲生物測(cè)定，持續(xù)4周，記錄每周活幼蟲數(shù)目。

1.8 多殺菌素緩釋劑對(duì)白紋伊蚊誘卵試驗(yàn) 按照1.4的試驗(yàn)方法加入0.2 g碳酸銨制成帶有引誘劑的Spi-lu-Block。根據(jù)WHO關(guān)于孳生地陷阱測(cè)試指南[11]進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，于40 cm×40 cm×40 cm規(guī)格養(yǎng)蚊籠中，在等面積范圍內(nèi)放置3個(gè)生測(cè)杯,試驗(yàn)組為用100 mL Spi-lu-Block浸出液浸潤(rùn)1 d的濾紙+100 mL去氯水，對(duì)照組為用100 mL Block浸出液浸潤(rùn)1 d的濾紙+100 mL去氯水，空白對(duì)照組為濾紙+100 mL去氯水；放入20只孕雌蚊，產(chǎn)卵1 d后收集濾紙，記錄各組中蚊卵的數(shù)目，計(jì)算誘卵率和產(chǎn)卵活躍指數(shù)。

誘卵率(OR)=試驗(yàn)組卵數(shù)/產(chǎn)卵總數(shù)×100%

產(chǎn)卵活躍指數(shù)(OAI)=(試驗(yàn)組卵數(shù)-對(duì)照組卵數(shù))/產(chǎn)卵總數(shù)

當(dāng)OR>50%，OAI>0時(shí)，表明試驗(yàn)組具有誘卵作用，反之，則具有趨避作用。當(dāng)OAI>0.3時(shí)，表明試驗(yàn)組具有顯著的誘卵作用。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)1.6中時(shí)間、幼蟲死亡數(shù)、幼蟲總數(shù)3個(gè)因子通過(guò)SPSS 22.0軟件Regression中Probit板塊計(jì)算致死中時(shí)(LT50)，對(duì)1.6、1.7中致死率數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行分析并繪圖，使用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)OR和OAI進(jìn)行分析并繪圖。

2 結(jié)果

2.1 多殺菌素緩釋劑液相測(cè)定 結(jié)果如圖1所示，緩釋劑中多殺菌素出峰時(shí)間約為5.6 min，峰型良好，不受其他雜質(zhì)峰影響。

圖1 緩釋樣品液相色譜圖

2.2 多殺菌素緩釋劑的緩釋性能 結(jié)果如圖2所示，純多殺菌素9 d最大溶出率為37.39%，且在第5天達(dá)到最大，無(wú)緩釋規(guī)律；緩釋劑中多殺菌素7 d平均緩釋率為14.54%(P<0.01)；重復(fù)試驗(yàn)之間無(wú)顯著差異(P=0.126)。

圖2 緩釋劑中多殺菌素與純多殺菌素釋放曲線

2.3 緩釋劑的殺滅與引誘效果

2.3.1 快速滅蚊效果測(cè)試 24 h幼蟲毒力測(cè)試結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)死亡數(shù)，與試驗(yàn)組存在極顯著差異(P<0.01),不同劑量的多殺菌素緩釋劑之間的滅殺效果存在極顯著差異(P<0.01)，重復(fù)試驗(yàn)之間無(wú)顯著差異(P=0.955)。

圖3 不同劑量多殺菌素緩釋劑的快速滅蚊效果

2種緩釋劑對(duì)白紋伊蚊幼蟲的致死中時(shí)如表1所示，緩釋劑與空白對(duì)照間的致死中時(shí)有顯著差異(P<0.05)；緩釋劑之間致死中時(shí)無(wú)顯著差異(P=0.963)。

表1 2種不同劑量緩釋劑對(duì)白紋伊蚊幼蟲的致死中時(shí)

2.3.2 長(zhǎng)效滅蚊測(cè)試 多殺菌素緩釋劑1個(gè)月長(zhǎng)效滅蚊效果測(cè)試結(jié)果如圖4所示，多殺菌素原藥對(duì)照組在第4周滅蚊效果突降，1個(gè)月平均滅蚊率為81.33%，2種多殺菌素緩釋劑的1個(gè)月平均滅蚊率分別為95.33%和86.80%；Spi-Block1組滅蚊率與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)；Spi-Block2組則受劑量因素影響與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P=0.566)。

圖4 多殺菌素緩釋劑1個(gè)月長(zhǎng)效滅蚊效果

2.3.3 引誘作用 結(jié)果如圖5所示，在白紋伊蚊孕蚊對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的產(chǎn)卵偏好選擇時(shí)，試驗(yàn)組的平均OR為83.71%，對(duì)照組僅為32.45%，試驗(yàn)組OAI為0.68，與對(duì)照組相比具有極顯著的誘卵效果(P<0.01)。

圖5 多殺菌素緩釋劑的誘卵效果

3 討論

目前，關(guān)于多殺菌素緩釋劑型的研究多以懸浮劑和微球制劑為主，其中多以高分子化合物作為輔料包埋藥物以達(dá)到控釋目的。Xu等以殼聚糖為載體制成多殺菌素微球緩釋劑[12]；Li等采用殼聚糖共沉淀法包埋多殺菌素進(jìn)行控釋[13]；Cheng等制備多殺菌素與碳酸銨復(fù)合微球防治沙棘繞實(shí)蠅成蟲[14]；Huang等以聚脲異氰酸酯為壁材制備6%呋喃威-多殺菌素微囊懸浮劑[15]。而多殺菌素的毒力作用研究則以小菜蛾、蚜蟲等農(nóng)業(yè)害蟲為主，針對(duì)蚊蟲等媒介昆蟲的研究還尚不充分[16-18]。本試驗(yàn)制備的緩釋片劑契合了白紋伊蚊容器型小水體的孽生習(xí)性且方便使用。選擇碳酸銨作為引誘劑集中蚊蟲進(jìn)行殺滅，可用于家庭、養(yǎng)殖場(chǎng)等環(huán)境防治白紋伊蚊。采用十六醇和聚乙二醇組成的緩釋層延長(zhǎng)了多殺菌素在水體中的釋放時(shí)間，達(dá)到了長(zhǎng)控緩釋的效果，但聚乙二醇在高溫潮濕的環(huán)境下會(huì)發(fā)生消融，后期將會(huì)優(yōu)化輔料與藥物比例提高穩(wěn)定性與短控緩釋效果。