雞星狀病毒、禽腎炎病毒和雞傳染性支氣管炎病毒多重PCR檢測方法的建立

欒慶東 , 曹 旭 ， 尹燕博 ， 王建琳

(青島農業大學動物醫學院 ， 山東 青島 266109)

家禽尿酸鹽沉積是由于體內嘌呤代謝異常而導致尿酸生成過多，或腎臟功能障礙而導致尿酸排出障礙造成體內尿酸水平過高，以尿酸鹽的形式在體內沉積，分為內臟型痛風和關節型痛風[1]。據報道，家禽尿酸鹽沉積在世界范圍內存在，是導致家禽死亡的重要因素之一[2]。引起雞尿酸鹽沉積的原因有多種，包括病原微生物感染、飼養管理和營養性因素等，其中病毒感染主要包括雞腎型傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)[2]、禽腎炎病毒(Avian nephritis virus，ANV)[3]和雞星狀病毒(Chicken astrovirus，CAstV)[4]。

腎型IBV是雞傳染性支氣管炎的主要類型之一，為γ冠狀病毒，具有強烈的嗜腎性，該病毒感染后改變了多種代謝途徑而導致腎臟損傷，臨床以腎臟腫大、蒼白，腎小管和輸尿管內尿酸鹽沉積為主要病理特征[5]，是多年來影響我國養雞業的重要疾病。ANV最初被認為是一種小核糖核酸病毒，2000年Imada等根據其核苷酸序列特征將之歸為星狀病毒，該病毒感染成年雞后無明顯臨床癥狀，感染雛雞引起生長發育緩慢和腎臟損傷，臨床患雞出現腹瀉、間質性腎炎和尿酸沉積等特征[6]。CAstV最初被歸為是腸道樣流感病毒，與臨床雞的矮小—發育遲緩綜合征、生長抑制等相關，雞星狀病毒感染肉雞后出現明顯的體重增長緩慢、腸道損傷和腎臟損傷等現象[7-10]，且部分毒株感染后出現明顯的尿酸鹽沉積[4,10]。近年來，不斷有研究報道我國存在雞星狀病毒感染[11-13]。

鑒于IBV、ANV和CAstV是引起雞尿酸鹽沉積的主要病毒，且在我國雞群中廣泛存在，本研究擬建立這3種病毒的多重PCR檢測方法，以期為臨床家禽尿酸鹽沉積的診斷及這3種病毒感染的監控提供方法，為這3種病毒感染引起疾病的流行病學研究及綜合防控提供基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒 雞星狀病毒(CAstV)、禽腎炎病毒(ANV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、J亞型禽白血病病毒(Avian leueosis virus subgroup J，ALV-J)、雞馬立克式病毒(Marek′s disease virus，MDV)、血清4型禽腺病毒-I群(Fowl adenovirus virus 4，FAdV-4)和減蛋綜合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)均為本實驗室鑒定保存毒株。

1.2 試劑和載體 DNAiso、RNAiso Plus、pMD18-T、M-MLV反轉錄試劑盒、2×Mix，均購自寶生物工程(大連)有限公司；TIANprep Mini Plasmid Kit、大腸桿菌感受態細胞DH5α，均購自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extraction Micro Kit，購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒核酸的提取與反轉錄 按照DNAiso和RNAiso Plus說明書提取FAdV-4、MDV、EDSV的DNA和CAstV、ANV、IBV和ALV-J的RNA，RNA按照M-MLV反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA，將DNA和cDNA保存在-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 引物設計與合成 根據GenBank中登錄的CAstV的ORF-1b基因、ANV的ORF-1b基因和IBV的N基因分別設計了3對特異性引物(表1)，引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

表1 CAstV、ANV和IBV檢測用引物序列

1.3.3 標準質粒的制備 將保存的病毒cDNA進行PCR擴增，每種病毒的反應體系均為25 μL：2×TaqMix 12.5 μL，模板1 μL，正向引物和反向引物各1 μL，用8.5 μL蒸餾水補足體系至25 μL。PCR擴增程序：第1階段95 ℃ 5 min；第2階段30個循環，94 ℃ 30 s，CAstV 55 ℃(IBV 57 ℃，ANV 50 ℃) 30 s，72 ℃ 1 min 30 s；第3階段72 ℃ 10 min。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。通過膠回收試劑盒回收目的片段，然后將各個目的片段連接到pMD18-T載體上，轉化后挑取單克隆，通過PCR驗證后陽性質粒送測序，測序正確的產物提取質粒。測序由北京睿博興科生物技術有限公司完成。

1.3.4 PCR擴增反應的條件優化 取CAstV、ANV 和IBV 的cDNA，在建立單項PCR反應條件基礎上，建立多重PCR檢測方法，優化多重PCR的退火溫度，以確定最佳反應條件。PCR擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.5 多重PCR的特異性、敏感性和重復性試驗 應用優化后的多重PCR分別對FAdV-4、EDSV、MDV和ALV-J進行特異性檢驗。提取CAstV、ANV 和IBV的標準質粒后測定其濃度并計算拷貝數，將標準質粒進行10倍倍比稀釋進行多種PCR敏感性的檢測，從而確定多重PCR檢測方法的最小檢測限度。以構建的標準質粒為模板，采用建立的多重PCR檢測方法，檢測第3周和第5周放置的模板，從而驗證所建立方法的可靠性和重復性。

1.3.6 臨床病料的檢測 隨機采集臨床尿酸鹽沉積雞的肝臟、腎臟等臟器，加入5倍量生理鹽水后勻漿。置于-80 ℃冰箱反復凍融3次，7 500 r/min離心取上清液，提取核酸。用單項PCR和本試驗建立的多重PCR方法進行檢測。

2 結果

2.1 單項PCR方法的建立 單項PCR的反應體系：2×TaqMix 12.5 μL、正向引物(10 mmol/L)和反向引物(10 mmol/L)各1 μL、模板 2 μL、ddH2O 8.5 μL；擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，CAstV55 ℃(IBV 57 ℃，ANV 50 ℃)30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，CAstV、ANV和IBV 均能擴增出預計條帶，大小分別為350 bp、794 bp和1 600 bp(圖1)，經測序結果均正確。

圖1 CAstV的ORF-1b基因、ANV的ORF-1b基因和IBV的N基因的PCR擴增結果

2.2 多重PCR檢測方法的建立 通過設置梯度退火溫度來確定多重PCR檢測方法的最佳退火溫度條件，最終確定多重PCR檢測方法的最佳擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53.1 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min(圖2)。

圖2 CAstV、ANV和IBV多重PCR檢測方法優化退火溫度

2.3 特異性檢測 取實驗室保存的毒株FAdV-4、EDSV、MDV的DNA和ANV、CAstV、IBV、ALV-J的RNA，RNA反轉錄為cDNA，按照已確認的多重PCR檢測方法的反應條件進行擴增。其中CAstV、ANV和IBV均可擴增出與預期一致的條帶，而FAdV、EDSV、MDV和ALV-J均無特異性條帶(圖3)。

圖3 CAstV、ANV和IBV多重PCR檢測方法的特異性

2.4 敏感性檢測 用TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒提取標準質粒，檢測標準質粒的濃度為CAstV 222 ng/μL、ANV 241 ng/μL和IBV 276 ng/μL，經公式換算得出拷貝數為CAstV 6.68×1010copies/μL、ANV 6.30×1010copies/μL和IBV 5.87×1010copies/μL。 將質粒10倍倍比稀釋后，經多重PCR檢測方法的檢測得出最低檢測限為CAstV 1.33×105copies/μL、ANV 2.10×102copies/μL和IBV 1.96×102copies/μL(圖4)。

圖4 CAstV、ANV和IBV多重PCR檢測方法的敏感性試驗

2.5 重復性試驗 為驗證所建立方法的可靠性和穩定性，以建立的標準質粒為模板，在第3周和第5周2個不同時間段使用不同PCR儀器進行檢測，第3周和第5周的檢測結果如圖5、圖6所示，CAstV的最低檢測限仍為1.33×105copies/μL，ANV的最低檢測限為2.10×103copies/μL，IBV的最低檢測限為1.96×103copies/μL。結果表明建立的方法具有可靠性和穩定性。

圖5 第3周重復性試驗

圖6 第5周重復性試驗

2.6 臨床病料檢測 采集臨床痛風病料20份，核酸經反轉錄后，同時采用單項PCR檢測方法和本試驗建立的多重PCR檢測方法進行檢測，2種檢測方法結果完全一致，IBV陽性率為15%，ANV陽性率為5%，CAstV陽性率為5%(圖7)。

圖7 CAstV、ANV和IBV多重PCR檢測方法對臨床病料的檢測結果

3 討論

家禽痛風是家禽常見的重要疾病之一，世界各地均有報道，大部分家禽痛風是群體發病且死亡率較高，有時可高達30%[14]。尿酸由肝臟產生，是鳥類氮代謝的最終產物，主要通過腎臟排出體外，當腎臟排出障礙，如輸尿管阻塞、腎臟損傷等，將導致高尿酸血癥，尿酸鹽將沉積于心臟、肝臟、腸系膜和氣囊表面等，嚴重病例可在脾臟和其他器官內沉積，內臟尿酸鹽的沉積可導致家禽死亡[15]。引起家禽痛風的原因比較復雜，診斷確定病因采取相應措施是有效控制家禽痛風的關鍵。近年來，臨床陸續檢出CAstV和ANV感染，且研究表明這2種病毒的感染可引起家禽尿酸鹽沉積[4,10,16-17]，引起我國學者的關注。對我國不同省份雞群樣品進行CAstV感染的血清學檢測結果表明，CAstV感染在我國雞群非常普遍；病原學檢測結果表明我國雞群中CAstV和ANV廣泛存在，且二者常常共同感染[11,18]。

傳統的病毒檢測方法包括病毒分離及電鏡觀察、瓊脂凝膠擴散、血凝抑制和酶聯免疫吸附試驗等血清學檢測方法，這些方法存在費時費力、試驗周期長或需要相應的抗體等不足，故分子生物學檢測方法在病原的檢測，尤其是病毒檢測方面得到了廣泛地應用[19]。故本試驗針對引起雞尿酸鹽沉積的3種病毒建立多重PCR檢測方法。

IBV基因編碼4種結構蛋白，分別為纖突糖蛋白(Spike protein，S)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，N)、膜蛋白(Membrane protein，M)和小囊膜蛋白(Envelope protein，E)，IBV的N蛋白是位于膜內部的結構蛋白，是IBV誘導免疫應答的主要結構蛋白，具有高度保守性[20]。CAstV和ANV均屬于禽星狀病毒屬[21]，包括兩端的非編碼區、Poly(A)尾和ORF-1a、ORF-1b、ORF-2三個開放閱讀框，其中ORF-1a和ORF-1b編碼非結構蛋白，ORF-2編碼衣殼蛋白，ORF-1b是整個基因組中非常保守的基因，常作為靶基因來檢測病毒[22-23]。本試驗分別以IBV的N基因、CAstV和ANV的ORF-1b基因設計引物，經反轉錄后擴增相應的基因，其條帶分別為1 600 bp、350 bp和794 bp，擴增條帶大小可明顯區分3種病毒；且建立的多重PCR方法僅能檢測相應的IBV、CAstV和ANV，其他常見病毒如FAdV-4、EDSV、MDV和LV-J經檢測均無條帶，表明該多重PCR方法具有良好的特異性。建立的多重PCR方法經條件優化，3種病毒的最低檢測限分別為CAstV 1.33×105copies/μL、ANV 2.10×103copies/μL、IBV 1.96×103copies/μL，具有較高的敏感性。用建立的多重PCR方法對臨床雞尿酸鹽沉積病例進行檢測，其檢測結果與單項PCR檢測結果一致，具有較好的穩定性。

本試驗針對臨床引起雞尿酸鹽沉積的IBV、CAstV和ANV，建立檢測這3種病毒的多重PCR方法，能同時檢測并區分這3種病毒，特異性強、敏感性高、穩定性好，可為臨床這3種病毒的檢測、雞尿酸鹽沉積的診斷及流行病學調查等提供有力的技術支持。