Box-Behnken響應面法優化壯藥黃杞中總黃酮的回流提取工藝

陳丹丹　班曉敏　林夏　楊溢　岑杏蔓

【摘 要】 目的：采用Box-Behnken響應面法優化壯藥黃杞的提取工藝。方法：以總黃酮為指標，以液料比、提取時間、提取次數為因素，正交試驗初步篩選工藝參數，BoxBehnken 響應面法作進一步優化。結果：最優工藝條件為：提取時間1.5 h，乙醇量為10倍，提取2次。結論：方法合理可靠，穩定，可預測性較優。

【關鍵詞】 壯藥;黃杞;總黃酮; 回流提取;Box-Behnken響應面法

【中圖分類號】R284.2【文獻標志碼】 A? 【文章編號】1007-8517（2022）05-0046-06

基金項目：廣西高校中青年教師科研基礎能力提升項目（2019KY1531）;廣西來賓市科技局科技攻關與新產品試制（來科攻202411）。

作者簡介：陳丹丹（1981-），女，壯族，碩士，講師，研究方向為生藥學。E-mail：76001566@qq.com

通信作者：林夏（1987-），女，漢族，博士，講師，研究方向為藥物制劑。E-mail：237161741@qq.com

Response Surface Method Was Use to Optimize the Extraction of Astilbin and Engelitin

From Zhuang Medicine of Engelhardia Roxburghiana Wall.

CHEN Dandan1 BAN Xiaomin2 LIN Xia^1*YANG Yi3 CEN Xingman4

1.Guangxi Health Vocational and Technical College， Nanning 5300232，China;

2.Guangxi Nanning the Sixth People's Hospital，Nanning 5300232，China;

3.The 923 Logistic Support Unit hospital of the PLA，Nanning 5300232，China;

4.Guangxi Guiping People's Hospital，Guiping 537200，China

Abstract：Objective Optimization of extraction technology of Zhuang medicine Engelhardia roxburghiana Wall. by orthogonal test and Box-Behnken response surface method. Methods According to the total flavonoids， the ratio of liquid to material， extraction time and extraction times were taken as factors， and the process parameters were preliminarily selected by orthogonal， test BoxBehnken the response surface method for further optimization. Results The optimum conditions were as follows： extraction time 1.5 h， ethanol 10 times， extraction 2 times. Conclusion The method is reasonable， reliable， stable and predictable.

Key words：Zhuang Medicine;Engelhardtia Roxburghiana Wall;Total Flavonoid;Reflux Extraction;Box-Behnken Response Surface Method

黃杞是胡桃科黃杞屬植物黃杞Engelhardia roxburghiana Wall.的干燥葉，主要分布在廣西、廣東、云南等亞熱帶地區。《中華本草》^[1]記載黃杞樹皮行氣化濕;葉可作茶飲，具有清熱解毒、生津止渴、解暑利濕的作用，可用于脾胃濕滯、胸腹脹悶、感冒發燒等的治療。1996年曾收載在《廣西中藥材標準》（第二冊），2011年收載于《廣西壯族自治區壯藥質量標準·第二卷》，壯醫認為黃杞味微甜，性涼。清熱毒，除濕毒，調氣道，谷道。用于痧病（感冒），發得（發熱），東郎（食滯），貨煙媽（咽炎）與中醫對其的認識基本一致^[2]。作為壯族常用藥之一，其藥用資源豐富，藥用歷史悠久，壯族地區的群眾常以葉煮水當茶飲，民間又稱“甜茶”，可消除暑熱口渴、食滯、腹痛，有降血脂，降血壓等功效^[3-4]，有部分壯族群眾利用黃杞的樹汁或樹皮的水提物來治療麻疹、皮炎等皮膚病^[5]。研究^[6-9]表明黃杞中含有豐富的次生代謝產物，主要含有黃酮類成分，此外還有醌類、甾類、三萜類等，黃酮類成分藥理作用廣泛，在抗凝血，抗血栓，降血脂，降血糖等方面表現出較強的藥理活性。在提取方面的報道僅見宋明明等^[10]采用正交試驗優選黃杞葉總黃酮的最佳提取工藝，制劑方面未見報告。

實驗開展黃杞總黃酮提取工藝的優化研究，在單因素試驗的基礎上，以料液比、提取時間、提取次數為變量，總黃酮提取率為指標，利用Box-Behnken應面法進一步優化回流提取工藝，響應面優化法與已有文獻報告的正交試驗優化比較，更能體現不同因素之間的交互作用對藥材提取率影響，更全面的和真實的反應提取過程中各個因素的交互作用，本研究的結果以期為黃杞的后續制劑開發提供了實驗依據和奠定了基礎^[11-19]。A67D4071-5767-49FE-868D-67CB7CFF2701

1 儀器與試藥

1.1 儀器 TU-1901紫外可見分光光度計（日本島津公司）;PRACYUM124-LCN電子分析天平（賽多利斯電子儀器公司）;KQ-250DB循環式多用真空;恒溫水浴鍋。

1.2 試藥 黃杞采自于廣西南寧賓陽縣陳平鎮，經本校中藥鑒定教研室劉安韜副教授鑒定為胡桃科植物黃杞Engelhardia roxburghiana Wall.的干燥葉。蘆丁對照品（中國上海詩丹德生物技術有限公司;批號：5981;純度：99%）。乙醇、甲醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純（廣東光華科技股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品10 mg，甲醇定容至50 mL，加無水甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 稱取黃杞藥粉5 g，加90%乙醇（料液比1∶10），提取2次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，精密吸取續濾液1 mL，揮干乙醇，用20 mL水溶解，超聲使其溶解，移入分液漏斗，加20 mL石油醚萃取，重復2～3次，至無色。棄去石油醚層，水層轉入分液漏斗，加20 mL乙酸乙酯萃取，重復3次，棄去水層，將乙酸乙酯層置于錐形瓶中水浴揮干，加入甲醇洗滌容器，將洗滌液轉移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的繪制 精密吸取配置好的蘆丁對照品0、1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，混勻，靜置6 min，加10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加4% NaOH溶液10 mL，再加水定容，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法，在500 nm波長處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標，濃度為橫坐標（C）進行回歸，得到標準曲線為A=0.0115C-0.0099（R2=0.9991），在0.008～0.049 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.3.2 精密度試驗 取蘆丁對照品溶液適量，按照“2.3.1”項下方法操作，連續6次，計算RSD為1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，按照“2.3.1”項下方法操作，在60 min內從起始時間開始每隔5 min測定1次吸光度，計算RSD為1.7%，表明溶液在60 min內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取6份黃杞藥材粉末，按照2.2供試品溶液的制備得供試品溶液6份，按照“2.3.1”項下方法操作，在500 nm波長處測定吸光度，各平行測定3次，取平均值，帶入回歸方程，計算樣品中總黃酮的含量和RSD值，RSD為1.8%，表明此方法重復性性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密吸取6份已知總黃酮含量的供試品溶液中，每份1 mL（已測得其總黃酮含量為0.0201 mg/mL），分別加入蘆丁溶液（濃度為0.01 mg/mL） 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL各 2份，按照“2.3.1”項下進行制備并測定，結果見表1，平均回收率為98.48%，RSD=1.06%，表明該方法科學合理。

2.4 供試品中總黃酮的測定 精密吸取“2.2供試品溶液的制備”中的溶液3 mL，定容至25 mL，按照“2.3.1”項下方法操作，在500 nm波長處測定吸光度，各平行測定3次，取平均值，測定樣品中總黃酮的含量。

3 單因素試驗

3.1 料液比 取黃杞粉末，過20目篩，稱取5 g，95%乙醇，提取1.5 h，提取2次，考察1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16料液比對總黃酮提取率的影響。結果如圖1所示，提取率隨著料液比的增加而升高，當料液超過到1∶14后，提取率基本變化不大，為節約溶劑，故選用1∶8、1∶10、1∶12進行響應面試驗分析。

3.2 提取時間 取黃杞粉末，過20目篩，稱取5g，95%乙醇，固定料液比1∶10，提取2次，考察0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h不同時間對總黃酮提取率的影響。結果如圖2所示，1 h提取率最高，隨著時間的增加，總黃酮提取率變化不大，故選擇1 h、1.5 h、2 h進行響應面優化分析。

3.3 提取次數 取黃杞粉末，過20目篩，稱取5g，95%乙醇，固定料液比1∶10，提取1.5 h，考察1次、2次、3次、4次、5次不同提取次數對總黃酮提取率的影響。結果如圖3所示，提取2次后，總黃酮提取率明顯下降，說明提取2次已經提取完全。故選擇1次、2次、3次進行響應面優化分析。

4 響應面優化法

4.1 優化試驗 在單因素試驗基礎上，選擇料液比（A）、提取時間（B）、提取次數（C）作為影響因素，總黃酮提取率（Y）作為評價指標，選取3因素3水平使用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面優化設計優化。因素水平及實驗結果見表2，表3。

4.2 方差分析 方差分析結果見表4，在一次項中，A、B、C項，只有C項對總黃酮提取率具有統計學意義（P<0.05），交互項均不顯著，說明各試驗因子對響應值的影響并非簡單的線性關系，失擬項F值為4.45，P=0.0924，失擬項不顯著，表明回歸模型和實測值能較好的擬合，可信度高，表明該模型擬合優度較好。利用軟件對試驗結果進行二次多元回歸擬合，對表的數據進行方差分析后得到模型的二次多項回歸方程為：

R=-27.972+4.197A+10.032B+5.043C+0.228AB-0.138AC-0.035BC-0.023A2-4.114B2-0.701C2A67D4071-5767-49FE-868D-67CB7CFF2701

影響因子對提取率的影響為：C>A>B。試驗模型可信分析，相關系數R2=0.9609，說明模型可以理解為96.09%試驗所得的黃杞總黃酮含量的變化擬合較好。分析說明，可用此試驗方法來提取黃杞總黃酮的工藝研究。

4.3 響應曲面圖分析 為了進一步研究變量之間的相互作用，應用Design Expert 8.0.6軟件模擬得到了各因素對黃杞總黃酮提取率的3D響應曲面圖和等高線圖，結果如圖4～圖6所示。由圖4～圖6可知，響應面曲面開口朝下，響應面曲線變化相對陡峭，等高線呈橢圓形，說明各因素的交互作用對黃杞總黃酮提取率的影響較為明顯。

4.4 黃杞總黃酮提取的優化和驗證 響應面優化試驗設計的最佳提取工藝為：料液比1∶10.2，提取時1.54 h，提取次1.92次，在此工藝下總黃酮提取率預測值為（7.352±0.010）%。考慮實際情況，將最佳工藝修正為：料液比：1∶10，提取時間1.5 h，提取次數2次。在修正的工藝條件下進行驗證試驗，重復5次，得到黃杞總黃酮提取率（7.328±0.010）%。結果見表5。

5 討論

目前，關于壯藥黃杞總黃酮提取工藝的研究報道主要是采用正交試驗設計。實驗先采用單因素試驗考察了料液比、提取時間、提取次數對其提取率的影響，然后進行Box-Behnken 試驗優化設計，最后以Design-Expert8.0.6軟件進行數據回歸和方差分析，將因素與結果的關系進行多項式擬合，篩選出最佳提取工藝。測得回歸方程的相關系數為0.9609，表明方程擬合良好。根據響應曲面及等高線圖，得到了各因素間的相互作用對黃杞總黃酮提取率的影響，響應面曲面開口朝下，響應面曲線變化相對陡峭，等高線呈橢圓形，說明各因素的交互作用對黃杞總黃酮提取率的影響較為明顯。

驗證試驗表明，該模型方法可靠性高。最終確定最優工藝，料液比1∶10，提取時間1.5 h，提取次數2次，在此條件下壯藥黃杞總異黃酮提取率為7.328%，明顯高于單因素試驗結果，為壯藥黃杞中總黃酮的后續制劑開發奠定基礎。

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（收稿日期：2021-07-14 編輯：陶希睿）A67D4071-5767-49FE-868D-67CB7CFF2701