金黃色葡萄球菌和沙門氏菌在啤酒中 生存情況的研究

付燕秋，呂志敏，王 智，于 佳

（青島市產品質量檢驗研究院，青島市產品質量檢驗技術研究所，山東青島 266000）

啤酒被認為是一種微生物安全性較高的飲料，因其含有許多內在的抗菌因素，包括酒精（2.5%vol～ 5.0%vol）、啤酒花苦味酸（約為17～55 IBU）、低pH（3.9～4.4）、高濃度二氧化碳（約為0.5%）、低溶氧量（＜0.1 mg/L）和缺乏營養物質[1]。此外，啤酒生產加工過程，如糖化、麥芽汁煮沸、巴氏殺菌、無菌過濾和冷藏等對維持微生物穩定性起到保護作用[1]。2012年，中華人民共和國衛生部發布《食品安全國家標準 發酵酒及其配制酒》（GB 2758—2012），取消了啤酒菌落總數和大腸菌群的檢測，僅需檢測金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。筆者從2019年負責成品啤酒微生物檢測以來，共檢測1 000余批次樣品，均未檢出兩種致病菌。這與一些研究結果一致，在啤酒中食品致病菌的存活率通常很低[2-5]。但HOMPESCH[6]的研究表明，沙門氏菌可在啤酒中存活長達63 d。L'ANTHO?N等[7]報告部分食品致病菌可在無酒精啤酒中生長。高松[8]的衛生監督監測報告結果顯示，162批次市售啤酒，共檢出致病菌3株，檢出率為1.85%。本文通過在啤酒中接種等量的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，在不同的抑菌條件下，靜態培養，研究其生長情況，以期為今后啤酒的微生物檢測工作提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC6538；鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028。培養基：7.5%NaCl肉湯、緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、Baird-Parker瓊脂、XLD瓊脂和營養瓊脂，北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

BSC-1304ⅡA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司；SHH-150L生化培養箱，重慶四達實驗儀器有限公司；2RH-250生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；SPX-250BSH-Ⅱ生化培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；FE20梅特勒酸度計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DensiCHEK plus比濁儀，BioMerieux。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物接種物制備

金黃色葡萄球菌和沙門氏菌菌株分別接種到營養瓊脂平板上活化培養。24 h后，挑取單一菌落用無菌生理鹽水通過比濁儀，配制比濁度為0.5的菌懸液，再用無菌生理鹽水稀釋目標接種物約為 105CFU/mL，備用。金黃色葡萄球菌目標接種物標記為J菌液；沙門氏菌目標接種物標記為S菌液。

1.3.2 實驗用啤酒準備

啤酒根據酒精含量分為無酒精（＜0.5%vol）、中酒精度（2.5%vol～3.6%vol）和高酒精度（≥4.0%vol） 啤酒。實驗用啤酒均為實驗室檢驗剩余樣品，具體見表1。

表1 實驗用啤酒

1.3.3 金黃色葡萄球菌在啤酒中的存活

將表1中的B1、B2、B3、B4和B5用無菌量筒各取250 mL置于無菌均質袋中，一式兩份。一份取 0.5 mL J菌液加入各均質袋，標記為Pn；另一份，不加菌液，作為陰性對照，標記為CK-。同時，再取 0.5 mL J菌液加入250 mL 7.5% NaCl肉湯中，作為陽性對照，標記為CK+。從Pn、CK-和CK+各均質袋中吸取1 mL，選擇適宜的稀釋度，涂布BP平板，36 ℃培養48 h后，計數。將Pn、CK-和CK+各均質袋，置于25 ℃，靜態培養，每天同一時間 計數。

1.3.4 沙門氏菌在啤酒中的存活

實驗操作同1.3.3。其中，J菌液換為S菌液；陽性對照培養基為250 mL緩沖蛋白胨水（BPW）；計數方法為20 mL冷卻至46 ℃的XLD瓊脂培養基傾注平板，36 ℃培養24 h后，計數。

1.3.5 在無酒精啤酒中儲存溫度和pH值對沙門氏菌存活的影響

啤酒標簽上標識貯存條件為5～25 ℃[9]。將接種S菌液的無酒精啤酒在5 ℃、15 ℃和25 ℃下，靜態培養，評估儲存溫度對沙門氏菌存活的影響。本文測得實驗用無酒精啤酒pH值為4.19，在啤酒的典型pH值范圍內[10]。沙門氏菌最適生長pH值為6.8～7.8[11]。用無菌過濾的HCl或NaOH調節pH值，15 ℃靜態培養，評估pH值為4.0、4.2、4.5和7.0時對沙門氏菌存活的影響。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌和沙門氏菌在啤酒中的存活情況

金黃色葡萄球菌在P1、P2、P3、P4和P5中的生存情況如圖1所示。25℃時，在P1、P2、P3、P4和P5中只存活了3～5 d，即使在無酒精啤酒P1中也不能存活，說明其在不同酒精度啤酒中均無法啟動生長。MENZ等[2]報道，麥芽汁中低水平的啤酒花苦味酸可以抑制革蘭氏陽性菌生長。圖1進一步佐證了這種保護作用，即使低水平的啤酒花苦味酸也會抑制金黃色葡萄球菌的生長并限制其存活。

圖1 酒精度對金黃色葡萄球菌在啤酒中存活的影響

沙門氏菌在P1、P2、P3、P4和P5中的生存情況如圖2所示。25 ℃時，在P2、P3、P4和P5中6～9 d 失去活性，而在無酒精啤酒P1中1 d后迅速生長。說明沙門氏菌在中、高酒精度啤酒中無法啟動生長，但能在無酒精啤酒中劇烈生長，這與L’ANTHO?N等[7]的研究一致。

圖2 酒精度對沙門氏菌在啤酒中存活的影響

2.2 在無酒精啤酒中儲存溫度和pH值對沙門氏菌存活的影響

儲存溫度對無酒精啤酒中沙門氏菌存活的影響如圖3所示。沙門氏菌在25 ℃時的生長速度明顯快于15 ℃ 時，而在5 ℃時則無明顯增殖現象。25 ℃時，沙門氏菌在5 d內從1.1×105CFU/mL到8.8×107CFU/mL， 達到最大菌群數。15 ℃時，有一個較長的滯后階段，14 d開始生長，且整個生長趨勢緩慢。5 ℃時，沙門氏菌未生長，也未在35 d后完全失活。

圖3 儲存溫度對沙門氏菌在無酒精啤酒中存活的影響

無酒精啤酒的pH值對沙門氏菌存活的影響如圖4所示。當無酒精啤酒pH值增加時，沙門氏菌生長得到增強，生長滯后階段變短。pH為4.2時，沙門氏菌14 d開始生長；pH為4.5時，13 d開始生長；pH為7.0時，僅1 d就開始劇烈生長。而pH為4.0時，其從10 d開始活性顯著下降，25 d后被滅活。由此可知，pH值是啤酒對沙門氏菌產生抑制作用的一個重要因素，將無酒精啤酒的pH值從初始的4.2增加至4.5和7.0導致繁殖速度加快和滯后階段減短，而pH值降低至4.0會使其失活。通常啤酒的pH值為3.9～4.4[7]。綜上所述，沙門氏菌在啤酒中難以生存。

圖4 pH值對沙門氏菌在無酒精啤酒中存活的影響

3 結論

本文研究了啤酒中兩種致病菌的生長和存活情況。在中、高酒精度啤酒中，兩種致病菌均無法生長存活。在無酒精啤酒中，金黃色葡萄球菌失活，這是由于啤酒花苦味酸的存在；沙門氏菌能迅速生長，但降低啤酒pH值生長被抑制。由此可見，國家標準強制要求檢驗的兩種致病菌在啤酒中存在的可能性較低，尤其在中、高酒精度啤酒中幾乎沒有致病菌傳播的風險。但由于沙門氏菌在低溫下滅活速度減慢，在低溫保存的鮮啤酒中存在被檢出的風險。此外，由于無酒精（＜0.5%vol）條件可以支持沙門氏菌的生長（特別是在pH值略高的情況下），因此對未經巴氏殺菌的無酒精啤酒產品，檢驗人員應在工作中加強對其的重視。