斑地錦及近緣種的HPLC 指紋圖譜鑒別研究

侯 靜，黎 理，景曉彤，梁 圓，韋珊珊，蔡 毅

（廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001）

斑地錦（Euphorbia maculataL.）作為地錦草藥材之一，收載于2015 年版《中國藥典》［1］，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃等功效，可用于治療痢疾、尿血、崩漏、瘡癤癰腫等疾病。斑地錦主要含槲皮素、山奈酚等標志性成分，具有保肝、治療宮頸癌、抗腫瘤抗高血糖、抑制胃癌細胞的增殖、抗骨質疏松及抗細胞毒性等藥理活性［2-13］。地錦組植物有10 個種，其中廣西壯族自治區（以下簡稱廣西）分布有5個種［14，15］，其形態相近、混生，藥材性狀極為相似，顯微特征基本相同，不易區分，在民間常將斑地錦與近緣種匍匐大戟（Euphorbia prostrataAit.）、千根草（Eu-phorbia thymifoliaL.）、臺西地錦［Euphorbia taihsiensis（Chaw et Koutnik）Oudejians］混合使用［16］，品種使用比較混亂。本研究采用HPLC 指紋圖譜的方法，對常見的幾種地錦草組植物進行鑒別研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Waters 2695 型高效液相色譜儀（2988 PDA 檢測器），賽智科技有限公司；AEG-220 型電子分析天平，日本島津公司；KQ5200B 型超聲波清洗器（40 kHz、250 W），昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.2 試藥 對照品槲皮素（批號100081-201610）、山奈酚（批號110861-202013），質量分數大于98%，中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，Merk 公司；甲醇為分析純，水為去離子水。

1.1.3 藥材 10 批斑地錦藥材和20 批近緣種均采集于廣西，經廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室蔡毅教授鑒定為斑地錦、匍匐大戟、千根草、臺西地錦，樣品來源見表1。

表1 斑地錦和近緣種樣品來源

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備 分別取30 批藥材粉末（過3 號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇-10%HCl（4∶1）10 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用乙醇-10%HCl（4∶1）補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

1.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取槲皮素、山奈酚對照品適量，分別置于不同量瓶中，加乙醇-10%HCl（4∶1）適量，超聲使溶解，放冷，加乙醇-10%HCl（4∶1）定容至刻度，制得質量濃度分別為0.4～0.7 mg/mL 的對照品溶液，經 0.45 μm 微孔濾膜過濾，密封，低溫避光保存，備用。

1.2.3 色譜條件 采用PBONTOSIL KROMAPLUS 100-5-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表2；體積流量為0.8 mL/min；檢測波長360 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度試驗 取斑地錦藥材（S1）制備成供試品溶液，按照“1.2.3”的色譜條件連續進樣6 次，記錄色譜峰。以槲皮素色譜峰（1 號峰）為參照峰，結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.63%，相對峰面積的RSD均小于1.43%，說明該方法精密度良好。

2.1.2 重復性試驗 取斑地錦藥材（S1）的粉末6份，按照“1.2.1”的方法制備供試品溶液，按照“1.2.3”的色譜條件記錄色譜峰。以槲皮素色譜峰（1 號峰）為參照峰，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.85%，相對峰面積的RSD均小于1.04%，表明該方法重復性良好。

2.1.3 穩定性試驗 取斑地錦藥材（S1）制備成供試品溶液，按照“1.2.3”的色譜條件，分別在 0、4、8、12、16、24 h 進樣，記錄色譜峰。以槲皮素色譜峰（1 號峰）為參照峰，結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.38%，相對峰面積的RSD均小于1.63%，說明樣品穩定性良好。

2.2 HPLC 指紋圖譜的建立

2.2.1 指紋圖譜建立及評價 取10 批斑地錦及其近緣種樣品，按照“1.2.1”和“1.2.2”的方法制備對照溶液及供試品溶液，按照“1.2.3”的條件，進樣分析。斑地錦及近緣種匍匐大戟、千根草、臺西地錦在120 min 內分別有 13、11、10、12 個共有峰，疊加圖譜分別見圖1 至圖4，共有模式圖譜見圖5。

圖1 10 批斑地錦HPLC 特征圖譜疊加效果

圖4 6 批臺西地錦樣品HPLC 特征圖及譜疊加效果

圖5 斑地錦及近緣種的共有模式

圖2 8 批匍匐大戟樣品HPLC 特征圖譜疊加效果

圖3 6 批千根草樣品HPLC 特征圖譜疊加效果

2.2.2 特征峰的標定和比對 根據10 批斑地錦的指紋圖譜（A）檢測結果，共標定2 個特征峰（圖6）。經過與對照品保留時間比對，可知1 號峰為對照品槲皮素，2 號峰為對照品山奈酚。

圖6 特征峰的標定和比對

2.2.3 相似度比較分析 對10 批斑地錦、8 批匍匐大戟、6 批千根草、6 批臺西地錦樣品進行相似度比較分析（表3），結果其相似度分別大于0.916、0.884、0.979、0.939，相似度良好。

表3 30 批斑地錦及其近緣種相似度評價結果

2.2.4 聚類分析 采用SPSS 21.0 分析軟件，以組之間鏈接及平方Euclidean 距離方法，對30 批樣品進行系統聚類分析。結果不同種可分為4 類（圖7），S1至 S10 聚為第一類，S25 至 S30 聚為第二類，S11 至S18 聚為第三類，S19 至 S24 聚為第四類。

圖7 30 批樣品指紋圖譜聚類分析

2.2.5 主成分分析（PCA） 采用SPSS 21.0 分析軟件對30 批樣品，以主成分的方差貢獻率為及特征值為依據，進行主成分分析，結果S11 至S18 樣品聚為一類，S19 至 S24 樣品聚為第二類，S1 至 S10 和 S25 至S30 樣品分別聚為2 類，且樣品點距離較近（圖8）。

圖8 30 批樣品指紋圖譜主成分分析

3 小結

本研究建立了斑地錦及其近緣種HPLC 指紋圖譜，斑地錦有13 個特征峰，匍匐大戟、千根草、臺西地錦分別有11、10、12 個特征峰，色譜峰具有明顯區別，并指認出2 個特征峰，分別為槲皮素和山奈酚。30 批樣品的HPLC 指紋圖譜聚類分析及相似度評價可知，S1 至S10 號為第一類，為斑地錦，（其相似度＞0.916），S11 至S18 號為第二類，為匍匐大戟（相似度＞0.884），S19 至 S24 號是第三類，為千根草（相似度＞0.979），S25 至 S30 號為第四類，為臺西地錦（相似度＞0.939）；斑地錦與匍匐大戟、臺西地錦、千根草的共有模式圖譜的相似度分別為0、0.581、0.116，匍匐大戟與臺西地錦、千根草的相似度分別為0.056、0.172，臺西地錦與匍匐大戟的相似度為0.166，從指紋圖譜、相似度、聚類分析、主成分分析都可證明該方法能夠較客觀地鑒別斑地錦及其近緣種藥材。

4 討論

相似度分析結果表明同種藥材樣品的質量穩定，差異小，受不同采收季節及產地的影響較小。斑地錦與臺西地錦、匍匐大戟、千根草之間的相似度較小，同時，比較它們的共有模式圖譜，不同種的色譜圖差異較大，表明它們的化學成分存在一定的差異。聚類分析、主成分分析結果一致，同種樣品聚為一類，將不同種樣品進行有效區分。

斑地錦作為地錦草藥材之一，收載于歷年版《中國藥典》，而千根草、匍匐大戟、臺西地錦與斑地錦為近緣種藥材，它們的藥材性狀、顯微結構特征等較為相似，在民間常混合使用。但相似度、共有模式圖譜、聚類分析、主成分分析結果均表明，斑地錦及其近緣種藥材的成分存在較大差異，能否混為使用有待進一步研究。