基于SRAP 標記的大別山薯蕷群體結構分析

李仁學 ，江 玲 ，顧 欽 ，李世升，李竟才

（1.黃岡師范學院生物與農業資源學院/大別山特色資源開發湖北省協同創新中心/湖北省經濟林木種質改良重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.廣西大學農學院/廣西高校植物遺傳育種重點實驗室，南寧 530004；3.嶺南師范學院附中東方實驗學校，廣東 湛江 440800）

薯蕷（Dioscorea alata）是薯蕷科（Dioscoreaceae R. Br.）薯蕷屬（Dioscorea）單子葉植物［1，2］。目前已知薯蕷科在全球共有10 個屬，大約650 個種，在中國只有 1 個屬，約 80 個種［3］。大多數薯蕷能在地下形成肉質塊根，可作為蔬菜食用，口感獨特、營養豐富，也可作為中藥材，具有降糖降脂，抗衰老等功效［4］。因薯蕷具較高的食用價值和藥用價值，人們對薯蕷的消費需求逐年上升。湖北省大別山地區具有獨特的地理和氣候優勢，種植薯蕷有300 多年的歷史，在薯蕷資源開發上具有獨特的優勢和良好的市場前景［5，6］。薯蕷的人工種植面積在大別山地區逐年擴大，具有較高的經濟效益，其中尤以佛手山藥最為出名。該地區于2009 年獲國家農產品地理標志認證（中華人民共和國農產品質量控制技術規范編號AGI2009-04-00165），地域保護范圍為湖北省大別山地區武穴市梅川鎮、余川鎮2 個鄉鎮現轄行政區域，地理坐標為東經 115°22′—115°49′，北緯29°50′—30°13′［7］。盡管大別山地區的薯蕷能產生較高的經濟效益，但育成的薯蕷品種遺傳背景相對狹窄，血緣關系相近，常年單一品種連作導致品種種性退化嚴重，利用遺傳背景寬廣的薯蕷種質資源選育出綜合性狀優良的品種顯得尤為重要。目前，利用分子標記對作物種質資源的選擇鑒定已成為研究熱點之一［8］。分子標記能對目標個體進行全基因組選擇，快速篩選出目標單株，縮短育種周期。此外，群體結構分析也是判斷品種間遺傳關系的重要途徑之一。在大別山地區，薯蕷的遺傳多樣性豐富，外來種的引入和一些栽培種的培育使分類和鑒定工作難度加大［9］，因此需要運用分子標記技術進行群體結構分析，對該地區的薯蕷品種進行分子水平的研究，得到不同品種之間的親緣關系。

薯蕷的遺傳關系及其相關性狀形成的分子機理較為復雜，有許多學者利用SRAP、ISSR、SSR 等標記做過相關方面的研究，如李齊向等［10］利用SRAP 和ISSR 分子標記對90 份薯蕷材料進行遺傳多樣性分析，發現SRAP 標記的多態性條帶和多態性條帶比率（PPB）比ISSR 標記高，更適合分析薯蕷的遺傳多樣性；華樹妹等［11］用系統聚類法構建遺傳距離樹狀圖將34 份薯蕷材料分為2 個類群，判斷出形態標記和分子標記都能將薯蕷的相關性狀區分開；張文芳［12］利用SSR 分子標記對37 個品種的薯蕷進行測序分析，發現其品種資源的遺傳距離和遺傳分化系數基本保持一致；趙容等［13］對穿龍薯蕷的遺傳多樣性進行分析，從分子水平研究不同薯蕷居群內及居群間的遺傳多樣性關系，了解不同居群薯蕷的遺傳差異。

使用分子標記來研究薯蕷遺傳多樣性的研究試驗較多，但大多是通過分子標記進行聚類分析［12-15］，而通過SRAP 分子標記對中國地方薯蕷種質資源進行的群體結構分析鮮有報道。本研究以大別山地區搜集到的48 份薯蕷種質資源為材料，運用SRAP 分子標記對其進行群體結構分析，為大別山地區薯蕷資源保護、遺傳研究和品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取的薯蕷材料包括Df2019200、Df2019202、Df2019203 等共計 48 份（表 1），具有廣泛的遺傳背景，均采自大別山地區，由湖北省經濟林木種質改良重點實驗室（黃岡師范學院）提供。

表1 材料編號及來源

1.2 儀器和主要試劑

1.2.1 儀器 GR60DF 型高壓蒸汽滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司）；JY-SCZ2 型垂直電泳槽（深圳至德科技有限公司）；JY-1600E 型垂直電泳儀（常州德杜儀器有限公司）；IM-25 型制冰機（HOSHIZAKI 公司）；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（鄭州宏朗有限公司）；Pax-250A 型光照培養箱（華城愛華儀器廠）；PTC-100PCR 儀（BIORAD 公司）；FastPrep-24TM5G核酸蛋白提取儀（AURORA 公司）；H-21 臺式離心機（江東儀器有限公司）；KE0012305 型微量移液槍（賽默飛世爾科技有限公司）；HH-2 型恒溫水浴鍋（歐萊博科學儀器有限公司）；-40 ℃冰箱（海爾集團公司）。

1.2.2 主要試劑 瓊脂粉、蔗糖、Ms 培養基（不含瓊脂粉和蔗糖）、0.1% NaOH 溶液、70%乙醇、95%乙醇、礦物油、Tris-base、10%過硫酸銨溶液、二甲苯氫、TBE 溶液（國藥集團）；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺（AMRESCO 公司）；Master Mix、DNA Marker、植物基因組DNA 提取試劑盒DP305（天根生化科技有限公司）；TEMED 催化劑（上海阿拉丁生化科技有限公司）。

1.3 組織培養和基因組DNA 的提取

從大別山地區收集的材料不易保存，為滿足試驗需要，對其進行組織培養處理。經無菌操作后將擴繁好的材料放入光照培養箱或者光照培養室（25 ℃，光照12 h）。將培養好的薯蕷材料取幼嫩葉片100 mg 左右放入2 mL 的離心管，用核酸蛋白提取儀進行破碎處理，得到植物組織的勻漿。用植物基因組DNA 提取試劑盒提取薯蕷的基因組DNA，用分光光度計測定DNA 濃度。

1.4 SRAP-PCR 擴增

PCR 反應體系15.0 μL，包括ddH2O 4.0 μL；Master Mix7.5 μL；上下游引物各1.0 μL；DNA模板1.5 μL；礦物油 1～2 滴。相關引物的合成參照 Li 等［16］研究。SRAP 引物具有特定的擴增程序：首先95 ℃預變性5 min；第一段循環5 次，95 ℃變性30 s，退火溫度為35 ℃持續30 s，72 ℃延伸 1 min；第二段循環35 次，95 ℃變性30 s，退火溫度為 50 ℃持續 30 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。所使用的引物組合（表2）：em1-Me13h、em2-me1、em3-me2、em4-me3、em6-me5、em7-me6、em8-me7、Em8h-Me9h、em9-me7、em9-me8、Em9h-Me9h、Em9h-Me10h、em10-Me6h、em10-me8、em11-Me6h、em11-Me8h、 Em11h-Me10h、 Em11h-Me11h、 Em12h-Me11h、 Em12h-Me12h、 Em13h-Me12h、 Em13h-Me13h。PCR 擴增產物用聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測，用AgNO3銀染顯色［17］。

表2 SRAP-PCR 擴增的引物序列

1.5 數據分析

將銀染后的聚丙烯酰胺凝膠放在燈箱上觀察并拍照，用Quantity one（Biorad 公司）讀帶分析。觀察聚丙烯酰胺膠不同引物位點的條帶，使用Lane Tools建立泳道并手動讀帶。讀帶完后在Match 下面找到Match 匹配，匹配好后在Reports 處輸出結果。得到的結果經數據處理后，相同遷移位置有位點處輸出為 1，無位點處記為0，缺失處記為-9［18］。

將得到的結果用Excel 輸出為TXT 格式，采用Structure2.3.4 分析軟件對48 份材料進行群體結構分析［19］。使用混合模型，先設置K范圍為 2～7，5 次重復，再設置Run Length，開始時的不作數迭代（Length of burnin period）為 100 000 次，不作迭代后的（Number of MCMC Reps of burnin）為 130 000 次。Structure 分析得到的結果保存在文件“Results”，將“Results”文件壓縮成Zip 格式，用于下一步的Structure Harvester 分析來確定出群體結構的最佳K。

2 結果與分析

2.1 SRAP 引物擴增結果分析

選用22 對具有明顯多態性的SRAP 引物，對48份薯蕷材料的基因組DNA 進行特異性擴增。22 對特異性引物總共擴增出266 條條帶，其中多態性條帶為 175 條。根據江東等［20］、劉湘萍等［21］計算多態性條帶比率，多態性條帶數/擴增總條帶數×100%，根據王晉等［22］計算多態性信息含量（PIC），其中Pij表示在位點i的第j個等位變異的概率。計算可得 22 對SRAP 引物平均多態性條帶比率為65.76%（表3）。各引物擴增出總條帶的范圍在6.00～16.00 條，多態性條帶的范圍在 4.00～11.00 條，平均每對引物擴增出的條帶為12.09 條，平均多態性條帶為7.95 條。多態性信息含量（PIC）在0.532 0～0.858 1，平均為 0.727 3。引物組 me2-em3、Me9hem8h 和Me11h-Em11h 的特異性最好，都能得到11.00 條多態性條帶，而Em9h-Me9h 特異性最差，僅有4.00 條多態性條帶；引物組Em8h-Me9h 的多態性條帶比率最高，為84.62%，而引物組em9-me7 多態性條帶比率最低，為50.00%。

表3 22 對SRAP 引物多態性統計

2.2 群體結構分析

基于SRAP 分子標記，利用Structure2.3.4 軟件對48 份大別山薯蕷材料進行群體結構分析。先設置K為 2～7，重復抽樣 5 次，在 Structure Harvester 軟件上在線分析。首先使用K的最大似然數法來判斷最佳K，以K為橫坐標，以其對數lnP（K）為縱坐標繪制曲線［23］（圖 1）。結果表明，隨著K增大，lnP（K）也逐漸增大，盡管lnP（K）的增長速率逐漸放緩，但并沒有出現拐點，所以該曲線圖并不能直接判斷出最佳K［24］。當無法直接找出K的最大似然數時，可通過△K（K的差值）的最大似然數來確定最合適的K［25］，因為△K同時考慮了對數lnP（K）的變化速率和方差，結果更準確［26］。根據Structure Harvester 的結果，當K取 3 時，DeltaK達到最大，并首次出現拐點（圖2）。所以可將48 份薯蕷材料分為3 個亞群（圖3）。圖中顏色的種類代表亞群的數目，紅色、綠色和藍色區域的個體代表所有的樣本可以分為3 個不同的亞群。序號為 20、21、23～35 的 15 份材料屬于紅色亞群，該亞群中的大部分個體與另2 個亞群存在基因交流，且20 號的個體雜合度最高，達到0.5 左右；序號為36～48 的13 份材料屬于綠色亞群，亞群中的個體大部分為純合個體，基因交流較少，基因型較為保守；序號為 1～19 和 22 的 20 份材料屬于藍色亞群，該亞群中包含的個體最多，4、6、7 和 13 號個體與另 2個亞群間基本上沒有基因交流，而其余個體均存在基因交流，且16、22 號個體雜合度較高，雜合度超過0.4。通過以上分析可推測雜合度較高的個體可能是外來引入，或者是不同親本間相互雜交產生的。

圖1 K 與 lnP（K）曲線

圖2 K 與 Delta K 曲線

圖3 大別山薯蕷群體結構分組

2.3 亞群劃分

根據采集地點（表1）和群體結構（圖3）分析，大致確定3 個亞群的范圍。亞群1 主要分布于高頭灣、余川小學、田慶二村、彭家灣、毛家灣、鼓嶺、郝家灣、老虎墩、蛤蟆壟和毛栗尖；亞群2 主要分布于方細灣、蘇家鋪、徐灣、梅家灣和王坦；亞群3 主要分布于肖家灣和塘凹。其中22 號個體在蘇家鋪采集，但卻劃分為亞群1，且個體高度雜合，可能是該個體由亞群1 和亞群2 的的親本經雜交產生。

3 討論

SRAP 分子標記也稱相關序列擴增多態性，是評價植物遺傳多樣性的一種高效、簡便的標記體系，由 Li 等［16］開 發 ，同 時 兼 具 了 RAPD 和 AFLP 的 優點［27］。通過1 對獨特的引物對開放閱讀框（ORF）進行PCR 擴增，最終由于物種以及個體之間的差異導致內含子和外顯子的間隔序列不同形成多態性。近年來，由于SRAP 分子標記操作簡便，引物設計簡單等優點，被廣泛應用于高等植物的遺傳多樣性研究、DNA 圖譜的構建等方面［28］。相較于其他分子標記，SRAP 分子標記產生的多態性位點更多，更適用于復雜植物基因組的研究。

中國薯蕷均屬于亞洲類群，目前只發現二倍體類群，暫未發現多倍體類群，但染色體及其核型組成較為復雜，不同亞群之間的染色體數差異較大，這直接導致了其遺傳結構復雜多樣。一般分子水平的研究無法準確定位其遺傳機制，而分子標記技術的興起為薯蕷遺傳多樣性的研究帶來了便利。十年前，已有學者開始用分子標記開展對薯蕷遺傳多樣性的研究。李勇慧等［29］用 AFLP 標記研究了 5 個薯蕷亞群的遺傳結構，其多態性條帶比率高達85.92%。AFLP 標記為第一代分子標記技術，盡管具有較高的多態性，但操作較為繁瑣，沒有SRAP 標記簡便。SRAP 標記基本上具有AFLP 標記所有優點，并且所需DNA 純度更低。本研究利用22 對SRAP 引物進行基因組DNA 擴增，擴增產生266.00 條條帶，其中多態性條帶175.00 條，平均多態性條帶比率為65.76%，最高一組引物組合的多態性條帶比率甚至達到84.62%，表現出較強的穩定性和較高的多態性 ，與 其 他 學 者［3，10，13，15］的 研 究 基 本 一 致 。 因 此 ，SRAP 分子標記可適用于薯蕷遺傳多樣性和群體結構分析。

在植物群體遺傳學的相關研究中，群體結構分析是最常見也是最初步的分析內容，能夠分析植物群體中的基因、基因型頻率的變化情況，從分子水平上揭示植物群體的遺傳關系、環境適應性等系列問題［30］。群體結構分析最常用的3 種方法是PCA、樹形圖以及 Structure 分析，而 Structure 分析與 PCA、樹形圖相比，除了能分析生物群體的遺傳結構，還可以分析群體間是否存在基因交流以及基因交流的程度有多少。本研究采用的Structure2.3.4 軟件能準確分析出群體數目、某個個體遺傳以及雜合個體的鑒定。

其他學者［31，32］對薯蕷遺傳多樣性的研究大多是基于相關性狀的聚類分析。聚類分析的原理是計算材料之間的遺傳相似系數，以此來判斷親緣關系的遠近，在選擇相似系數的水平上會帶有個人主觀因素而造成誤差［22］，而群體結構分析是根據貝葉斯模型來模擬計算亞群的最佳K，避免了人為主觀因素，所以群體結構分析用于薯蕷遺傳多樣性的研究更為可靠。本研究中薯蕷亞群的最佳K為3，表示可將48 份薯蕷材料劃為3 個亞群。3 個亞群中的部分個體并不是單獨在一個亞群中存在，而是在3 個亞群中互相滲透。亞群1 的個體數較多且分布分散，與其他亞群基因交流較多，基因和基因型組成較為復雜，具有豐富的遺傳多樣性；亞群2 的個體比亞群1的個體稍少，與其他亞群間也存在基因交流；亞群3個體數最少但分布比較集中，基因和基因型相對保守，與其他類群交流較少。3 個亞群的劃分與大別山地區特殊的薯蕷地理分布有關，該地區有著豐富的薯蕷資源，并由于地理隔離，從而導致亞群的基因頻率、基因型頻率發生改變，形成不同的亞群。而同一亞群中的某些個體與其他個體基因型相差極大，可能是外來種的引入以及交叉種植等原因造成的。

薯蕷作為大別山地區重要的經濟作物，其種質資源種類繁多，種植范圍較廣，地理隔離、外來引種和人工選育等原因導致某些種群基因型發生了變化，影響了大別山地區薯蕷的生產引種和品種改良。所以，首先要保證當地優良品種的基因純合，避免與其他外來種隨意交叉種植，造成后代性狀分離嚴重，不利于種質資源的收集和利用，其次，為防止連作導致優良品種種性退化，可選擇當地優良的推廣品種與外來農藝性狀較好的品種通過雜交產生新變異，獲得雜種，并通過選擇與比較鑒定進行優中選優，從而培育出更高產、優質的新品種。在種質資源收集和利用中，可以對遺傳多樣性豐富的地區進行重點保護，盡可能地多進行單株選育，培育出性狀優良的種子和幼苗。同時，可結合分子標記、生物信息學和高通量測序技術，揭露薯蕷的遺傳關系以及重要農藝性狀形成的分子機理，為大別山地區薯蕷資源保護、遺傳研究和品種改良奠定基礎。

4 結論

大別山地區的薯蕷具有豐富的遺傳特性。建議對大別山地區的薯蕷資源進行重點搜集和保護，除合理利用當地的種質資源外，可適當引種來進一步拓寬其遺傳多樣性，為薯蕷品種改良和生產實踐提供指導。