鄂馬鈴薯3 號遺傳轉化體系的構建與表達

高志鵬，杜玉蕭，馮 霞，余土元，李亞男，陳大清

（1.仲愷農業工程學院農業與生物學院，廣州 510225；2.長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025；3.長江大學發展規劃處，湖北 荊州 434023）

硒（Se）是植物生長發育的重要營養元素［1］，其在人畜營養健康和環境保護中的重要性也受到了廣泛的關注。硒代半胱氨酸甲基轉移酶（SMT）參與催化甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）的合成，是植物硒代謝的中心環節［2］。甲基化作用避免硒摻入到蛋白質中，從而顯著提高植物對硒的耐受性［3］。同時，硒的抗氧化性和抗癌特性也是一大研究熱點［4］，MeSe-Cys 的抗癌活性較強，能誘導癌細胞的凋亡，抑制血管腫瘤發生，阻止早期癌細胞的擴展，其應用前景樂觀［5］。據報道硒代半胱氨酸甲基轉移酶基因（SMT）在黃芪、西蘭花等植物中獲得了克隆［6］。不同植物中的SMT序列存在較高的同源性，甲基化作為硒的主要代謝途徑，富硒植物具有高聚集甲基半胱氨酸的顯著特征。黃芪（Astragalus bisulcatus）幼芽中的硒也主要轉化成了 MeSeCys［7］。Neuhierl 等［8］基于聚硒植物中SMT 對SeCys 的偏好性，認為通過提高對SeCys 的甲基化能力可降低硒對蛋白質的非特異性結合。在外源施加硒酸鹽的情況下，MeCys 的合成與MeSeCys 積累是相伴而存的，這說明二者的生物合成可能處于共同關聯的途徑上［9］。在過表達SMT的轉基因植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中研究發現此酶參與了MeSeCys 和MeCys 的合成，推測該酶在生物體外可以催化 SeCys 和 Cys 的甲基化［10］。擬南芥克隆的SMT序列與擬南芥中的硒代高半胱氨酸甲基轉移酶基因（HTM）序列存在70%同源性［11］，推測二者催化甲基化機制上具有相似性。Nikiforova 等［12］通過對擬南芥中SMT基因進行過表達，增加了植株對硒的耐受性和聚集能力。印度芥菜（Brassica juncea）中的BjSMT也被驗證能夠增強植株對亞硒酸鈉耐受性以及促進葉片的硒轉化能力［13］。據測定轉基因植株的硒積累量較野生型高，尤其是亞硒酸鹽顯著高于野生型，表明通過超表達SMT調控植株的耐硒能力和硒積累是一個有潛在應用價值的途徑［14］。在此基礎上通過轉基因技術在植物中對SMT進行過表達，可以有效增強植物中硒的富集量［15］，為開發有效富硒農產品提供了可能。近年來對于植物硒吸收、轉化以及代謝等分子機制研究取得了較大的進展，為研究植物的富硒機制提供了數據支持［16，17］。馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是有效的轉基因植物生物反應器［18］，又是糧蔬兼用作物，而關于以馬鈴薯為材料進行AbSMT基因的研究鮮有報道，因此本研究選擇馬鈴薯作為黃芪轉化硒代半胱氨酸甲基轉移酶（AbSMT）基因的受體植物，希望通過轉基因調節馬鈴薯的硒積累水平，提高植物源性的生物有機硒的補充來源，具有重要的社會經濟意義［19］。通過運用農桿菌轉化法構建AbSMT基因轉化的馬鈴薯植株，為后續開展該物種的轉基因工作或通過基因編輯提高馬鈴薯有機硒含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 鄂馬鈴薯3 號脫毒試管苗由華中農業大學園藝植物生物學教育部重點實驗室提供。

1.1.2 質粒與菌種 大腸桿菌Top10，農桿菌LBA4404，質粒 pBI121，含有AbSMT基因序列的質粒pBinAr，加利福尼亞大學伯克利分校Danika 教授惠贈。

1.1.3 試劑 X-Gluc（武漢明銳生物技術有限公司），DNA Marker、Taq 酶、限制性核酸內切酶、T4 連接酶、吲哚乙酸、奈乙酸、赤霉素、羧芐青霉素、卡那霉素、利福平（武漢天源生物有限公司）。

1.1.4 引物AbSMT基因擴增引物（上游：5′-GCTCTAGAATGTCGTCGCCATTGAT-3′；下游：5′-CGGGATCCTTACTAGTAGATTTGTTTGC-3′ ） PCR檢測引物（上游：5′-CTAACAGAACTCGCCGTAAA-3′；下游：5′-CGGGCAATCTCAACACTT-3′）。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織誘導與分化培養培養基的選擇 馬鈴薯外植體莖段移植到愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織。根據愈傷組織誘導情況，把誘導的愈傷組織轉入分化培養基進行分化培養。直到分化出的再生植株長到2～3 cm 時，從愈傷組織上切下再生苗插入生根培養基中生根培養。以上培養條件均為溫度18～22 ℃，光照度3 000 lx，每天光照16 h。每15 d繼代培養一次。愈傷組織誘導及分化培養培養基為 MS 基本培養基附加植物激素（表1），pH 5.8，瓊脂1.5%，蔗糖3%。

表1 愈傷組織誘導及分化培養培養基配方

1.2.2 馬鈴薯外植體的擴繁及預培養 取一株帶有4～5 個莖節的脫毒試管苗，在無菌條件下切成單節莖段，轉接到裝有50 mL 固體培養基的150 mL 三角瓶中，在培養溫度25 ℃，光照度1 500 lx 的培養箱中培養，每天光照16 h。待試管苗長至4～5 個莖節時，在同等條件下進行擴繁。將馬鈴薯莖段轉移到愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織。

1.2.3AbSMT基因的克隆及其表達載體的構建 依據cDNA 全長序列設計引物：（分別帶有XbaⅠ和BamH Ⅰ酶切位點）以質粒 pBinAr 中的AbSMT為模板進行 PCR 擴增。PCR 擴增體系為：2.0 μL 10×TaqBuffer，1.2 μL MgCl2，0.2 μL dNTP，0.8 μL TaqDN-ase，3.0 μL cDNA 模板，0.6 μL 引物（含上游引物和下游引物），加去離子水定容至20.0 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預變性4 min，進入循環：94 ℃變性1 min，58 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，進行30 個循環后，72 ℃保溫10 min。

另外，用XbaI 和BamH I 分別酶切質粒pBI121和PCR 產物。分別回收純化酶切片段，用T4 連接酶進行連接并轉化至TOP10 感受態細胞中，在含有50 mg/L Kan 的LB 培養基上篩選轉化菌落，挑取單菌落進行菌落PCR 鑒定。陽性克隆接種培養后于15%甘油保存，取1 mL 菌液置于1.5 mL 離心管中送上海生物工程有限公司測序，比對測序結構從而準確篩選出正確的克隆pBI121-AbSMT。其表達載體pBI121-AbSMT結構如圖 1 所示。

圖1 表達載體pBI121-AbSMT

1.2.4 根瘤農桿菌感受態細胞的制備 挑取農桿菌LBA4404 的單菌落接種于5 mL YEP 液體培養基中，28 ℃，160～250 r/min 振蕩培養過夜。取2 mL 菌液轉入50 mL YEP液體培養基中，繼續培養至OD600nm為0.3～0.5。轉入無菌離心管，冰浴10 min 隨后4 000 r/min離心10 min，去上清液，加入40 mL（50 mmol/L）CaCl2重懸菌液，離心10 min，去上清液。5 mL 預冷的50 mmol/L CaCl2懸浮細胞，冰浴備用。YEP 培養基成分如表2 所示。

表2 YEP 培養基成分

1.2.5 植物表達載體pBI121-AbSMT向農桿菌感受態細胞的轉化及陽性克隆的鑒定 取200 mL 感受態細胞，加入20 μL 構建好的質粒DNA，冰上放置10～20 min，液氮中速凍2 min，28 ℃水浴5 min，然后加入1 mL YEP 培養基，28 ℃慢速（＜200 r/min）振蕩培養 4 h；涂布于含有 50 mg/L Kan 和 100 mg/L Rif 的YEP 平板上，28 ℃培養約48 h。挑取YEP 平板上的單菌落，接種于含有50 mg/L Kan 和100 mg/L Rif YEP 液體培養基中，28 ℃振蕩培養過夜；少量提取質粒DNA，以質粒DNA 為模板進行PCR 擴增鑒定。

1.2.6 農桿菌遺傳轉化體系的確定及轉化 將無菌馬鈴薯莖段切成長約0.5 cm 大小，轉接到含有卡那霉素依次為 20、30、50、75、100 mg/L 的 A2 培養基上篩選抗生素濃度。

篩選陽性克隆接種于50 mL YEP 液體培養液中（含有 50 mg/L Kan 和 100 mg/L Rif），28 ℃、200 r/min振蕩培養至OD600nm為 0.6～0.8。轉移至 50 mL 離心管中，4 000 r/min 離心 10 min，收集菌體后，用 MS 液體培養基重懸菌體。再次離心收集菌體后，用MS液體培養基重懸菌體調整菌液濃度至OD600nm分別為0.3、0.5、0.7 進行菌液濃度探究，將預培養后的外植體分別置于上述濃度菌液中，室溫下緩慢搖動，使外植體與菌液充分接觸［20］。當外植體在菌液中分別處理4、8、10 min 以確定最佳的農桿菌侵染時間，分別取出外植體并用無菌水沖洗3 次，用高壓滅菌的濾紙吸去多余水分后轉移到愈傷組織培養基中。于28 ℃下分別于暗處共培養1、3、5 d 以確定最佳共培養時間，隨后將外植體轉接到愈傷組織培養基中進行選擇培養。

1.2.7 轉化馬鈴薯的繼代培養及PCR 檢測 外植體培養20～30 d 后，將其轉移到分化培養基中進行繼代培養，直到愈傷組織產生再生苗。將分化培養基中得到的再生苗轉移到生根培養基中誘導生根，待生根后，于MS 培養基中進行轉化苗的大量繁殖。挑選轉化苗，利用PCR 檢測引物進行PCR 檢測。培養基配方見表3。

表3 馬鈴薯培養基（1L）

1.2.8 轉化馬鈴薯的GUS 組織化學染色 將植物材料放在50%丙酮溶液中，在室溫下浸泡30 min。取出材料，用無菌水沖洗一次，然后用pH 7.0 的磷酸緩沖液沖洗3次。室溫下，在染色液中浸泡48 h。將浸染過的材料轉入70%乙醇中脫色，至陰性對照材料呈白色為止［21］，在實體鏡下觀察GUS基因表達情況。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導與分化培養培養基的選擇

將馬鈴薯莖段分別培養在3 種不同的愈傷組織培養基中，15 d 后統計成愈率。結果顯示，3.00 mg/L的 6-BA 和0.08 mg/L 的 NAA 的組合能夠最大限度促進愈傷組織的形成（圖2），成愈率為96.25%（表4）。從圖3 可知，在此愈傷組織培養基的基礎上，發現 6-BA 和 GA3 濃度分別為 1.00、3.00 mg/L 時，更有利于促進愈傷組織分化出不定芽，不定芽的發生頻率最高達38%（表5）。

表4 不同生長調節劑配比對馬鈴薯愈傷組織成愈率的影響

表5 不同生長調節劑配比對馬鈴薯愈傷組織分化率的影響

圖2 馬鈴薯愈傷組織誘導結果

圖3 馬鈴薯愈傷組織不定芽的誘導

2.2 AbSMT 基因表達載體的構建及鑒定

以含有AbSMT目的基因的質粒pBinAr 為模板，用帶有XbaI 和BamH I 酶切位點的定向克隆引物擴增得到基因兩端帶有酶切位點的AbSMT基因（圖4）。從LB 培養基中挑取單菌落進行菌落PCR 鑒定，PCR產物電泳可見大小約1 067 bp 的特異條帶（圖5），與預期大小一致。初步說明表達載體pBI121-AbSMT構建成功。然后對菌落PCR 鑒定為陽性的單菌落進行搖菌培養后提取質粒，用XbaI 和BamH I 雙酶切鑒定，電泳可見2 條大小約14 kb 和1 067 bp 的目的條帶（圖6），再一次證明pBI121-AbSMT構建成功。把經鑒定含有目的片斷的表達載體送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行DNA 序列測定。測定結果經分子生物學軟件DNAMAN 分析，結果證實表達載體pBI121-AbSMT構建成功。

圖4 AbSMT 基因 PCR 電泳結果

圖5 菌落PCR 電泳結果

圖6 pBI121-AbSMT 酶切電泳結果

2.3 根癌農桿菌的轉化鑒定

選取經測序確定的pBI121-AbSMT重組質粒經凍融法轉化農桿菌LBA4404 感受態細胞，從轉化平板上挑取單菌落，小量提取質粒進行PCR 鑒定，PCR產物可見與表達載體pBI121-AbSMT擴增大小相同約為1 067 bp 的特異條帶（圖7），從而證明pBI121-AbSMT重組質粒成功轉入到農桿菌LB4404 中。

圖7 轉化農桿菌PCR 檢測

2.4 農桿菌轉化體系確定

外植體莖段培養在含有50 mg/L 的Kan 的愈傷組織培養基中，前期生長緩慢，3～4 d 后，莖段中間變黑，但兩端有少量的愈傷組織，隨著愈傷組織的繼續生長，70%以上的莖段完全變黑，且生長趨勢下降，50 mg/L 的Kan 濃度可以作為外植體篩選的抗生素濃度。菌液濃度的大小因不同的植物具有差異性，試驗結果表明，農桿菌菌液濃度為0.50（OD600nm），侵染時間為8 min時，芽的分化率最高，達37.5%（表6）。共培養1 d，農桿菌感染和轉移不充分，細胞受抗生素的過早抑制，分化率僅為8%，共培養超過5 d，由于農桿菌的大量生長，外植體被農桿菌菌落覆蓋，難以控制污染，分化產生的抗性芽很難成活（表7）。因此，確定共培養時間為3 d。

表6 不同農桿菌濃度和侵染時間對抗性芽分化率的影響

表7 共培養時間對芽分化的影響

2.5 轉化馬鈴薯植株PCR 檢測

用CTAB 法提取轉化植株的DNA，以未轉化馬鈴薯植株為陰性對照，陽性轉化農桿菌為陽性對照，利用檢測引物進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示轉化苗與陽性對照有相同的長度約800 bp 的條帶，證明成功構建了AbSMT基因轉化的鄂馬鈴薯3 號（圖8），共篩選到了1 株陽性轉化馬鈴薯植株（圖9）。

圖8 馬鈴薯抗性植株PCR 鑒定

2.6 GUS 組織化學染色檢測

經過GUS 染色后，在陰性對照材料中沒有觀察到藍色斑點，在轉基因馬鈴薯中可以觀察到清晰的藍色GUS 表達位點（圖10）。說明AbSMT基因成功轉化并且在植株中表達。

圖10 轉化植株與非轉化植株的GUS 組織化學染色比對分析

3 小結與討論

采用農桿菌介導馬鈴薯轉基因的方法已經逐漸成熟，應用很廣泛。在農桿菌侵染過程中，農桿菌在植物細胞表面的附著是實現T-DNA 轉移和整合的前提，因此控制農桿菌的濃度及侵染時間是實現高轉化效率的關鍵［22］。濃度太高、侵染時間過長會使傷口褐化，軟腐增多，后繼培養中農桿菌難以控制，轉化率下降。濃度太低、侵染時間過短將會達不到轉化的目的。共培養時間也是影響轉化效率的重要因素之一，時間過短不能為目的基因轉移到植物細胞內創造充分的機會，時間過長會增加產生假轉化體的機率［23］。上述因素以及具體的抗生素篩選濃度等也因不同的基因型、不同的外植體而異，必須通過試驗驗證，以達到最佳的轉化效果［24］。本研究分別對菌液濃度、侵染時間及共培養時間進行了試驗。試驗結果顯示，篩選抗生素是50.00 mg/L 的Kan；農桿菌菌液濃度為0.50（OD600nm）；侵染時間為8 min；共培養時間為3 d，能夠實現高效遺傳轉化，可為后續開展該物種轉基因試驗提供參考。

目前對于參與植物硒代謝相關酶類的研究較多，硒代半胱氨酸甲基轉移酶又是植物緩解硒毒害的關鍵酶類［2-6］，然而有關SMT基因的研究在過去發展仍較緩慢。國內近期以茶樹、毛薯為植物材料開展SMT基因功能及其表達量等研究居多［25］。在農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化研究中，薯塊無須脫分化可直接誘導再生，成為薯遺傳轉化中應用較多的外植體［26］。本研究基于鄂馬鈴薯3 號遺傳轉化體系研究的基礎上，采用農桿菌介導法進行AbSMT轉化馬鈴薯的研究。經過PCR 鑒定和GUS 組織化學染色的初步鑒定分析，確認成功實現了AbSMT基因對鄂馬鈴薯3 號的遺傳轉化。通過GUS 組織化學染色分析，在轉化植株的葉片中觀察到了AbSMT基因的表達。為進一步研究AbSMT基因功能及其表達調控機制提供了試驗參考。此外，GUS基因瞬時表達受到共培養時間及農桿菌菌株種類的影響，共培養時間不僅決定著遺傳轉化的效率，同時也影響GUS基因瞬時表達，二者呈現一定的負相關性，共培養時間越長對GUS基因表達越不利［27］。不同的農桿菌菌株的感染毒力存在差異，LBA4404 菌株的感染毒力明顯低于 EHA101 菌株和 EHA105 菌株［28］。這可能是造成其他組織部位GUS基因表達異常的原因。