基于分子對接和網絡藥理學探討半枝蓮治療腦梗死的作用機制

聶玉婷，張 磊，司 童，劉 瑤，高 利，曲 淼

腦卒中是世界第二、我國首位的死亡原因，且我國人群腦卒中發病率明顯高于世界平均水平[1]。缺血性腦卒中占腦卒中的80%以上，腦卒中后病人大部分遺留殘疾，失去工作和生活的能力，給社會和國家造成嚴重的經濟負擔。急性腦梗死損傷機制涉及氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等多個途徑，但是目前多數藥物只能針對急性腦梗死病理過程的某一環節，因此，多靶點藥物研發迫在眉睫。半枝蓮具有清熱解毒、活血祛瘀、利尿消腫等功效。有研究表明，半枝蓮總黃酮可在一定程度上降低軸索過度生長抑制因子的表達，改善腦缺血小鼠的認知功能[2]。張立波等[3]研究發現，半枝蓮總黃酮能減輕急性腦梗死缺血再灌注大鼠大腦皮層神經炎癥反應，減輕神經元損傷。沈宏友等[4]給予腦缺血再灌注損傷大鼠半枝蓮總黃酮(140 mg/kg)灌胃治療，發現其可以通過調控細胞凋亡減小腦梗死體積。本研究旨在探索半枝蓮治療腦梗死的網絡藥理學機制，進一步明確半枝蓮治療腦梗死的作用機制。

1 資料與方法

1.1 篩選半枝蓮的關鍵化合物 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)，以“半枝蓮”為關鍵詞，以口服生物利用度(OB)>30%和藥物相似性(DL)>0.18 為條件篩選主要有效活性成分及相應靶點，通過 UniProt 數據庫(https://www.uniprot.org)對靶點進行注釋。

1.2 疾病靶點篩選 以“cerebral infarction”為關鍵詞在 GeneCards(https://www.genecards.org)與 OMIM(https://omim.org)數據庫進行檢索，Relevance score設置為≥3，去除重復靶點，篩選腦梗死的疾病靶點。通過R語言包install.packages(“Venn Diagram”)，得到半枝蓮-腦梗死共同靶點基因。

1.3 藥物-關鍵化合物-疾病靶點的網絡可視化 使用 Cytoscape 3.7.2 軟件進行可視化處理，構建“半枝蓮-關鍵化學成分-腦梗死-靶蛋白”網絡關系圖。

1.4 靶蛋白互作(PPI)網絡構建 將半枝蓮-腦梗死共有的靶點基因輸入String(https://string-db.org/cgi/input.pl)建立靶蛋白互作網絡圖，將蛋白關系評分設為 0.4，隱藏游離蛋白，得到 PPI 網絡圖。選取前 20個鄰接點最多的基因，用 R 語言繪制柱狀圖。

1.5 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 利用 R 軟件安裝 Bioconductor相關安裝包(“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”)，以P<0.05 為標準，進行GO富集分析和KEGG富集分析。

1.6 核心活性成分-靶點分子對接驗證 將PPI網絡中節點度值(Degree)參數排名前4位的基因和對應的化合物進行分子對接，利用PyMOL將對接結果可視化。

2 結 果

2.1 半枝蓮關鍵化學成分的篩選 在TCMSP數據庫搜索半枝蓮的化學成分，得到104個化學成分。以OB>30%且DL>0.18 為標準進行篩選，得到29 個關鍵化合物。詳見表1。

表1 半枝蓮關鍵化學成分

2.2 藥物-疾病靶點 去除重復靶點，篩選得到腦梗死的1 714個蛋白靶點基因，通過R語言包install.packages(VennDiagram)得到半枝蓮-腦梗死的共同靶點基因57個。共同靶點分別為環加氧酶1(PTGS1)、雌激素受體1(ESR1)、孕酮受體(PGR)、核受體亞家族3C組成員2(NR3C2)、核受體亞家族3C組成員1(NR3C1)、雄激素受體(AR)、雌激素受體2 (ESR2)、糖原合成激酶-3β(GSK3β)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)、膽堿能受體1(CHRM1)、γ-氨基丁酸A型受體α1亞單位(GABRA1)、B淋巴細胞瘤-2基因(BCL2)、半胱氨酸蛋白酶-9 (CASP9)、半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、半胱氨酸蛋白酶-8 (CASP8)、蛋白激酶Cα(PRKCA)、對氧磷酶1(PON1)、凝血因子Ⅶ(F7)、尿激酶型纖溶酶原激活劑(PLAU)、V-Rel網狀內皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)、細胞周期蛋白D1(CCND1)、白細胞介素- 6(IL-6)等。韋恩圖詳見圖1。

圖1 半枝蓮與腦梗死疾病靶點的韋恩圖

2.3 “半枝蓮-關鍵化學成分-腦梗死-靶蛋白”網絡構建 使用 Cytoscape 3.7.2 構建“半枝蓮-關鍵化學成分-腦梗死-靶蛋白”可視化網絡圖。在該網絡中，共包含節點 86 個，其中半枝蓮、腦梗死節點各 1 個，半枝蓮有效成分節點27個，半枝蓮治療腦梗死的潛在靶點57 個。其中槲皮素(quercetin)、漢黃芩素(wogonin)、黃芩苷(baicalein)、木犀草素(luteolin)等成分相關的節點數較多，是半枝蓮治療腦梗死的主要有效成分。詳見圖2。

圖2 半枝蓮-關鍵化學成分-腦梗死-靶蛋白網絡圖

2.4 PPI 蛋白互作網絡關系 將半枝蓮與腦梗死共同的 57個靶點基因導入 STRING 數據庫平臺，研究物種選擇人類，獲取蛋白質相互作用關系，篩選評分>0.4分的蛋白關系，并繪制蛋白互作關系網絡圖，詳見圖3。通過計算每個基因的連接節點數目，得到前 20個PPI核心基因，為IL-6、CASP3、血管內皮生長因子-A(VEGF-A)、表皮生長因子受體(EGFR)、ESR1、MYC、CCND1、AR、FOS、PPARG、細胞色素C(CYCS)、RELA、內皮一氧化氮合成酶(NOS3)、CAV1、APP、CASP8、缺氧誘導因子-1A(HIF-1A)、NR3C1、PGR、CASP9，即半枝蓮治療腦梗死的核心基因，前5位分別為IL-6、CASP3、VEGF-A、EGFR、ESR1，涉及的信號途徑包括血管生成、炎癥、細胞凋亡等。詳見圖4。

圖3 半枝蓮-腦梗死靶點PPI網絡圖

圖4 半枝蓮-腦梗死靶點PPI網絡柱狀圖

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析結果顯示，共獲得 73條GO生物學過程，靶點基因主要富集于類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、類固醇結合(steroid binding)、DNA結合轉錄因子(DNA-binding transcription factor binding)、配體激活轉錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA結合轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、DNA結合轉錄激活劑活性及RNA聚合酶Ⅱ-特異性(DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific)、DNA結合轉錄激活劑活性(DNA-binding transcription activator activity)、激活轉錄因子結合(activating transcription factor binding)、泛素蛋白連接酶結合(ubiquitin protein ligase binding)等生物學過程。詳見圖5。

圖5 GO功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析結果顯示，半枝蓮治療腦梗死的關鍵基因靶點主要富集的通路有109條，其中與腦梗死密切相關的信號通路主要有糖尿病并發癥晚期糖基化終末產物與其受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、細胞凋亡通路(apoptosis)、p53信號通路(p53 signaling pathway)等。詳見圖6。

圖6 KEGG 功能富集柱狀圖

2.7 半枝蓮治療腦梗死活性成分干預關鍵靶點的分子對接預測 網絡藥理學預測關鍵靶點為IL-6、CASP3、VEGFA、EGFR，使用 AutoDock Vina軟件對關鍵靶點與對應化合物進行對接，結合能≤-5 kJ/mol證明分子與靶點對接較好，分子對接結果顯示IL-6與木犀草素、槲皮素、漢黃芩素，CASP3 與木犀草素、槲皮素、漢黃芩素、黃芩苷，VEGFA與木犀草素、槲皮素、黃芩苷，EGFR與槲皮素、木犀草素具有較好的結合力，詳見表2。將關鍵靶點與結合能最低的活性化合物用PyMoL作圖，詳見圖7。

表2 半枝蓮有效化合物與作用靶蛋白的結合分數情況

圖7 分子對接圖

3 討 論

本研究共檢索出半枝蓮的有效化學成分29種，其中槲皮素、漢黃芩素、黃芩苷、木犀草素是半枝蓮治療腦梗死的主要有效成分。槲皮素具有抗炎、抗凋亡[5]、神經保護[6]、抗氧化[7]、抗動脈粥樣硬化[8]、抗腫瘤[9]等作用，腹腔注射槲皮素(30 mg/kg)能明顯縮小腦梗死面積，減少神經行為缺損，抑制神經元丟失[10]。另外，槲皮素明顯抑制缺血誘導的基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)升高，減輕全腦缺血誘導的神經元損傷[11]。漢黃芩素具有抗炎、抗氧化[12-13]、抗腫瘤[14]等作用，可明顯改善促進慢性腦缺血區細胞增殖和血管發生，減輕炎癥反應[15]。Ahang等[16]研究發現黃芩苷可以促進腦源性神經生長因子(BDNF)的表達，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達，減輕腦缺血再灌注損傷。在大腦中動脈閉塞模型中，黃芩苷可以抑制MMP-9表達，減輕其所致的神經元損傷、腦水腫和血腦屏障通透性[17]。黃芩苷抑制腦缺血時Toll樣受體2(TLR2)/ Toll樣受體4(TLR 4)信號通路，這可能是黃芩苷神經保護作用的機制之一[18]。一項動物研究提示，黃芩苷對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用是由腸道微生物區系介導的，黃芩苷可能通過重塑腸道微生物來改善腦缺血-再灌注模型小鼠的神經功能，抑制神經炎癥反應，使腸道微生物組成恢復正常[19]。木犀草素具有抗菌、抗病毒、抗炎、鎮痛[20]、抗腫瘤[21]的作用。木犀草素通過下調炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β和IL-6，上調抗氧化激酶活性，減輕腦缺血損傷程度[22]。

由PPI網絡獲得關鍵靶點，得到前 20個PPI核心基因，為IL-6、CASP3、VEGFA、EGFR、ESR1、MYC、CCND1、AR、FOS、PPARG、CYCS、RELA、NOS3、CAV1、APP、CASP8、HIF-1A、NR3C1、PGR、CASP9，排在前3位的是IL-6、CASP3、VEGFA。對關鍵靶點進行分析，腦梗死后炎癥和凋亡是梗死后損傷的關鍵環節。IL-6是重要的炎性因子，急性腦卒中病人血漿IL-6水平升高，IL-6水平升高與較大的梗死體積和不良預后相關[23]。半枝蓮總黃酮可通過降低IL-6等炎性因子水平而發揮抗動脈粥樣硬化的作用[24]。Caspase-3是凋亡酶級聯反應中的重要蛋白，其下調可減輕神經細胞凋亡和腦缺血再灌注損傷，缺血半暗帶可能是Caspase-3介導的[25]。一項動物實驗證明，半枝蓮通過調節Caspase-3、Caspase-9抑制神經細胞凋亡[26]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)對缺血性腦卒中起重要作用，是最強的缺氧誘導血管生成因子[27]，目前對VEGFA的研究最廣泛。VEGFA可通過改善腦缺血再灌注來挽救神經組織，并參與側支血管形成。通過以上分析可以發現這些靶點與缺血性腦卒中主要富集于炎癥反應、細胞凋亡、血管生成等方面。

根據KEGG通路富集分析結果推測半枝蓮可能通過干預糖尿病并發癥晚期糖基化終末產物與其受體信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、細胞凋亡通路、p53信號通路發揮治療腦梗死的作用。晚期糖基化終產物受體上調可引起腫瘤壞死因子-α表達，參與腦缺血損傷過程[28]，另有文獻表明，晚期糖基化終產物受體可增強血管損傷和膠質細胞介導炎癥而導致遲發性神經元死亡[29]。動脈粥樣硬化與剪切應力密切相關，是腦卒中的主要原因，已有研究表明，半枝蓮可以調節血清磷脂轉運蛋白水平，改善血脂、血液流變學，進而減少動脈粥樣硬化損傷[30]。p53是參與腦缺血損傷后神經細胞凋亡的重要因子，具有促凋亡作用，在大鼠急性全腦缺血再灌注模型中，p53蛋白表達增加，神經細胞凋亡和 p53蛋白的表達在一定時間內呈正相關[31]。有實驗研究表明，半枝蓮能減弱Bax和p53 蛋白表達、減少大鼠神經細胞凋亡[32]。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學方法，預測了半枝蓮防治腦梗死的主要化學成分、關鍵靶標，明確了半枝蓮通過多成分、多靶點、多途徑作用于腦梗死，為半枝蓮用于改善腦梗死的藥物研究提供了依據。