賈躍進老中醫常用藥對半夏-夏枯草治療失眠障礙作用機制的網絡藥理學研究

楊青婷，劉 毅，王瑞敏，付 璐，賈躍進

失眠障礙(insomnia disorder，ID)作為一種臨床常見病，患病率為10%～20%，是一些軀體和精神疾病發展的危險因素，其特征為在有適當的睡眠條件下，仍持續存在睡眠的啟動、維持或質量方面的困難，并伴隨某種形式的日間功能損害[1-2]。盡管失眠障礙給人們的身心健康造成了較大的危害，但是目前仍然缺乏理想的治療藥物[3]，而中藥治療失眠障礙臨床應用廣泛，發揮治療作用的同時未見不良反應的報道[4]，因此，挖掘中醫藥可為失眠障礙的藥物治療提供新的思路。

賈躍進老中醫是全國名老中醫工作室指導老師，有40余年臨證經驗，尤擅長治療包括失眠障礙在內的多種神經內科疾病，在治療失眠障礙時常應用半夏-夏枯草藥對，并效驗甚眾。因此，根據中藥多成分、多靶點、多通路的復雜網絡特性，選取網絡藥理學方法研究半夏-夏枯草治療失眠障礙的有效成分、靶點和通路以探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分與靶點搜集 以“半夏”“夏枯草”為關鍵詞，在中藥系統藥理學技術平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索藥物有效成分及相關靶點，并按照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，血腦屏障(blood brain barrier，BBB)≥-0.3，類藥性(drug likeness，DL)≥0.18進行篩選，將所得靶點在UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)中匹配基因名。

1.2 疾病靶點與藥物-疾病交集靶點搜集 以“insomnia disorder”為關鍵詞在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/#)及TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)數據庫中檢索以搜集疾病靶點，并將藥物有效成分靶點與其取交集，以Venn圖表示。

1.3 疾病-藥物-成分-靶點網絡和蛋白互作關系(PPI)網絡構建 利用CytoscapeV3.6.1構建失眠障礙、半夏-夏枯草、有效成分及相關靶點的相互關系網絡，再將交集靶點利用STRING數據庫(https://string-db.org/)構建PPI網絡，并在Cytoscape中限定節點度以進一步構建核心PPI網絡。

1.4 基因本體(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 在Metascape平臺(https://metascape.org/)中導入所得交集靶點并獲取GO分子功能、細胞成分、生物過程和KEGG通路富集分析，然后運用在線作圖平臺ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)繪制富集氣泡圖。

1.5 核心成分和核心靶點分子對接 通過疾病-藥物-成分-靶點網絡及PPI網絡中的核心有效成分和核心靶點，將其分別在ZINC(http://zinc.docking.org/)、PDB(http://www.rcsb.org/)數據庫中匹配3D結構，而沒有結構記錄的靶點則利用SWISS-MODEL平臺(https://swissmodel.expasy.org/)模擬構建其3D結構，然后預處理結構文件，并使用AutoDock vina及PyMol進行分子對接和構象可視化。

2 結 果

2.1 半夏、夏枯草有效成分與靶點搜集結果 通過檢索TCMSP數據庫及限定藥物OB、BBB、DL值篩選有效成分。經去重排除后，半夏-夏枯草藥對共搜集到12種有效成分、73個關聯靶點。詳見表1。

表1 半夏、夏枯草有效成分基本信息

2.2 失眠障礙疾病靶點與藥物-疾病交集靶點獲取結果 在GeneCards、OMIM和TTD數據庫中檢索失眠障礙，合并去重后共獲得失眠障礙靶點2 916個。將其與半夏-夏枯草藥對的73個靶點取交集，得到藥物-疾病交集靶點33個，該33個靶點分屬10種成分。詳見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點

2.3 疾病-藥物-成分-靶點網絡和PPI網絡構建結果 藥對-藥物-成分-靶點網絡構建結果見圖2，有87節點、196條邊；疾病-藥對-成分-交集靶點網絡構建結果見圖3，有45個節點、127條邊。結合以上兩個網絡圖并利用Cytoscape內置網絡分析插件計算節點度，得出節點度大于2倍中位數的核心有效成分5個。再導入33個交集靶點到STRING數據庫，設置物種為智人，獲得PPI網絡(見圖4)，以靶點為節點，蛋白互作關系為邊，有33個節點數、146條邊，平均節點度為8.85，平均局部聚類系數為0.62；同樣使用Cytoscape分析PPI網絡(見圖5)，篩選節點度大于11的靶點為核心靶點并構建網絡，可得核心靶點為：低聚果糖(FOS)、蛋白激酶(AKT1)、單胺類氧化酶A(MAOA)、5-羥色胺3A受體(HTR3A)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、5-羥色胺轉運體(SLC6A4)、α-(1B)-腎上腺素受體(ADRA1B)。

圖2 藥對-藥物-成分-靶點網絡圖

圖3 疾病-藥對-成分-交集靶點網絡圖(BX-XKC為半夏-夏枯草)

圖4 PPI網絡圖

圖5 PPI核心網絡圖

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析結果 在Metascape平臺中對交集靶點分別進行GO和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析得到540條結果，包括生物過程447條、分子功能56條以及細胞成分37條；KEGG通路富集分析得到37條結果，再限定P<0.01，最小計數為3，富集因子>1.5篩選，繪制富集氣泡圖(見圖6)。富集分析所得主要生物過程包括：腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、成長調節、單胺運輸、膜電位調節等；分子功能主要涉及腎上腺素受體活性、兒茶酚胺結合、神經遞質受體活性、單胺跨膜轉運蛋白活性等；細胞成分則主要有突觸后膜的組成部分、受體復合體等；通路則包含神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、脂肪細胞中的脂肪分解調節等。然后構建通路、交集靶點相互關系的網絡(見圖7)，其中神經活性配體-受體相互作用通路節點度明顯高于其他通路，因此可以判斷藥對最可能通過該通路發揮作用，其具體作用機制見圖8。

圖6 富集分析氣泡圖

圖7 靶點-通路關系圖

圖8 神經活性配體-受體相互作用通路機制

2.5 核心成分與核心靶點分子對接結果 核心成分與核心靶點分子對接結果均小于-20.92 kJ/mol(見表2)，可見核心成分均可能與核心靶點結合成穩定結構。使用Pymol將核心靶點與核心成分對接最穩定的組合的對接構象可視化(見圖9)。

表2 核心活性成分與核心靶點分子對接結果 kJ/mol

圖9 核心成分與核心靶點分子對接構象圖

3 討 論

失眠障礙相當于中醫的“不寐”，賈躍進老中醫對于不寐有其獨特的認識，其結合《黃帝內經》：“衛氣不得入于陰，長留于陽，則陽氣滿，陽氣盛則陽蹻盛，不得入與陰則陰氣虛，故不目瞑[5]。”對不寐病理機制進行闡述，認為其總病機為“營衛失和，陰陽不交”[6]，因此，治療不寐的關鍵在于調和陰陽、引陽入陰。而《冷廬醫話》記載：“蓋半夏得陰而生，夏枯草得至陽而長，是陰陽配合之妙也”[7]。故賈躍進老中醫常以兩藥相配，寒溫并用，平衡陰陽，引陽入陰，治療不寐。此外，臨床觀察證實該藥對治療失眠障礙確有療效[8]，現代藥理學研究則發現該藥對有鎮靜催眠、抗驚厥、抗抑郁等作用[9-10]。綜上所述，半夏-夏枯草治療失眠障礙有其理論和臨床依據。

本研究疾病-藥物-成分-靶點網絡所得的核心成分中，A成分是一種天然植物甾醇，可通過增加γ-氨基丁酸(GABA)、谷胱甘肽(GSH)水平，減少多巴胺(DA)、丙二醛、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，降低乙酰膽堿酯酶(AChE)活性，對動物精神病癥狀有一定的改善作用[11]；成分B也是植物甾醇類成分，研究認為其可明顯增加小鼠腦中去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)，介導抗抑郁樣活性[12]；成分BX3是一種重要的黃酮，在體外和體內系統均具有神經保護特性[13]；BX2是來自多種植物的生物堿，可抑制炎性因子表現出抗炎的作用，而炎性因子亦參與睡眠的調節[14-15]。通過篩選PPI網絡所得的核心靶點中，FOS表達涉及喚醒狀態的調節[16]；AKT1編碼的AKT1激酶則在神經元細胞間通訊、神經元存活和記憶形成中發揮作用；MAOA編碼的單胺氧化酶A參與血清素、腎上腺素、NE和DA等神經遞質的分解，而這些神經遞質參與調控睡眠-覺醒周期；HTR3A編碼5-HT受體，SLC6A4編碼調控5-HT的膜蛋白，而5-HT是已知的促覺醒和抑制快速眼動睡眠的神經遞質[17]；ADRA1B受體參與誘導松果體合成褪黑激素以調控晝夜節律[18]；VEGFA則對GABA能神經元產生影響[19]。

GO富集分析所獲得的主要生物過程中以腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路和單胺運輸兩個生物過程為主，其中是α-腎上腺素能受體功能是動物和人類睡眠-蘇醒調節的關鍵組成部分[20]；而包括DA、血清素和NE在內的單胺類物質則已證實與睡眠-覺醒密切相關。KEGG通路富集分析所得通路則主要以神經活性配體-受體相互作用及血清素能突觸為主，目前已知的GABA、5-HT等促睡眠因子及DA、NE等促覺醒因子均通過此通路發揮作用[21]。分子對接結果可得核心成分與核心靶點均可能形成穩定結構，進行數據分析可以進一步篩選出對接較好的關鍵成分：A(豆甾醇)、BX5(新隱丹參酮)、B(β-谷甾醇)以及對接較好的關鍵靶點(AKT1、SLC6A4、HTR3A、MAOA)。綜合以上中醫理論、網絡藥理學、分子對接以及臨床驗案，可以得出賈躍進老中醫應用半夏-夏枯草藥對治療失眠障礙符合中醫“引陽入陰”的治療大綱，并且臨床確有療效，而其具體則可能由豆甾醇、新隱丹參酮、β-谷甾醇等關鍵成分結合AKT1、SLC6A4、HTR3A、MAOA等關鍵靶點，即通過調控AKT1激酶及5-HT、DA等單胺類物質，藉由神經活性配體-受體相互作用及血清素能突觸等通路發揮作用。