騏龍血脈健方對ApoE-/-小鼠主動脈功能及TSP-1/CD36介導血小板活化的影響

封 銳，王丹丹，師 帥，李樹斌，姜 北，胡元會，

動脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中等多種血管疾病的發病基礎。研究表明，70%～80%的動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)是易損斑塊和繼發血栓形成所導致的[1]，而血小板的活化、黏附、聚集是血栓形成的初始環節[2]。這些動脈硬化性心血管疾病屬中醫“痰濁”“血瘀”的范疇，而痰與瘀密切相關，日久可相互搏結而致病，現代研究發現，血小板活化、內皮損傷、血栓形成等均為痰瘀證的病理表現[3-5]。胡元會教授潛心研究多年創制的騏龍血脈健方是治療痰瘀互結型心腦血管疾病的有效方劑，本研究通過復制載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化模型，探究騏龍血脈健方對主動脈功能和血小板反應蛋白-1(TSP-1)/CD36介導血小板活化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 騏龍血脈健方(配方顆粒，四川新綠色藥業研制)，由黃連、全瓜蔞、法半夏、血竭、茯苓等組成，阿托伐他汀鈣片(商品名：立普妥，輝瑞公司生產)。

1.1.2 動物與飼料 選用無特定病原體(SPF)級 8 周齡雄性 ApoE-/-小鼠 40 只及C57BL/6J野生型小鼠 8 只，購自北京維通利華公司，許可證SCXK(京)2016-0006，于中國中醫科學院廣安門醫院實驗動物中心飼養。以西方飲食飼料(脂肪 21%、膽固醇 0.15%)飼養 ApoE-/-小鼠；以標準飼料喂養C57BL/6J 小鼠。本實驗嚴格遵守國家動物福利倫理及保護規定進行動物飼養及操作。

1.1.3 主要設備與器械 低溫高速離心機(Sigma，Germany)、MSE125P-1CE-DU精密電子分析天平(Sartorius，Ger3many)，Navios 流式細胞儀， Vevo 2100超高分辨率小動物超聲影像系統(Visual Sonics，Canada)。

1.1.4 主要試劑 Anti-Thrombospondin 1 抗體(Abcam，England，ab85762)，Ms CD61FITC 2C9.G2 100 μg(BD Pharmingen，China，561911)，Ms CD62P Alexa 647 RB40.34 50 μg(BD Pharmingen，China，563674)，Ms CD36PE CRF D-2712 100 μg(BD Pharmingen，China，562702)

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及建模 將 40只8周齡雄性ApoE-/-小鼠按隨機數字表法分為模型組、立普妥組、中藥大劑量組、中藥中劑量組、中藥小劑量組，每組8只，予高脂飲食喂養14周。另選取8只8周齡雄性C57BL/6J小鼠作為空白組，予以標準飼料喂養。

1.2.2 給藥方法 以0.9%氯化鈉注射液將中藥配方顆粒配成中藥混懸液，隨用隨配，置于 4 ℃冰箱保存，并以0.9%氯化鈉注射液將阿托伐他汀鈣片配成藥品溶液，與中藥混懸液同樣條件保存。空白組及模型組以每天10 g體重0.1 mL給予氯化鈉注射液(0.009 g/mL)；立普妥組以每天10g體重0.1mL給予立普妥溶液(0.300 3 mg/mL)；中藥大劑量組以騏龍血脈健方臨床用量的20倍(36.04 g/mL)、中劑量組以騏龍血脈健方臨床用量的10倍(18.02 g/mL)、小劑量組以騏龍血脈健方臨床用量的5倍(9.01 g/mL)配制溶液，按照10 g體重0.1 mL進行灌胃。每日灌胃1次，共持續14周，實際用藥量根據每周體重動態調整。

1.2.3 取材及處理 末次灌胃完成后，所有小鼠空腹 12 h后取材。①取血：以摘眼球方式獲得血液，采集后置于采血管中保存，以3 000 r/min(4 ℃)速度離心10 min，分離得到血清和血漿，置于-80 ℃冰箱保存。 ②取材：脫臼法處死實驗動物后，小心剪開皮膚及腹膜，打開胸腔剪除臟器，使用注射器將0.9%氯化鈉溶液從小鼠心尖部注入左心室進行沖洗。小心地分離主動脈周圍的脂肪直至完整暴露。隨后小心剝離主動脈束，置于凍存管中，液氮冷凍后迅速置于-80 ℃冰箱內保存[6]。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 小鼠腹主動脈內徑超聲影像檢測 造模結束前 3 d，腹腔注射巴比妥鈉麻醉小鼠，控制心率在 350 次/min左右，麻醉成功后，平臥位固定小鼠，腹部備皮，采用超聲影像系統測定小鼠腹主動脈收縮末期內徑(systolic diameter，Ds)、舒張末期內徑(diastolic diameter，Dd)。Ds及Dd均測量3次，取平均值。

1.3.2 主動脈TSP-1蛋白檢測 采用蛋白印跡法測定小鼠主動脈TSP-1 蛋白表達[7]。

1.3.3 血小板活化率及CD36表達率檢測 采用流式細胞技術檢測血小板活化率及CD36表達率，建立前向角(FSC)-側向角(SSC)散點圖，參照空白和同型對照，調節儀器閾值、FSC，FL1、FL2、FL6 通道增益和電壓，以收取 5萬個陽性事件為終止條件。先在前色相中標記出 CD61+的部分，作為C門；以CD61+/CD36+區域為D門；CD61+/CD62P+區域為E門。CD36+CD62P-CD61+%為血小板CD36表達率；CD36-CD62P+CD61+%為血小板活化率。

2 結 果

2.1 各組小鼠腹主動脈Ds、Dd比較 與空白組比較，模型組主動脈Ds及Dd明顯減小(P<0.01)。與模型組比較，立普妥組與中藥大劑量組主動脈Ds及Dd明顯增大(P<0.01)，中藥中劑量組、小劑量組主動脈Ds均明顯增大(P<0.01)，中藥中劑量組主動脈Dd增大(P<0.05)，中藥小劑量組Dd增大不明顯(P>0.05)。詳見表1及圖1、圖2。

表1 各組小鼠腹主動脈Ds、Dd比較(±s) 單位：mm

與空白組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△ P<0.01。圖2 各組小鼠腹主動脈Ds、Dd柱狀圖

圖1 各組小鼠腹主動脈超聲圖

2.2 各組小鼠主動脈TSP-1蛋白表達比較 與空白組比較，模型組主動脈TSP-1 蛋白表達明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，立普妥組、中藥大劑量組 TSP-1蛋白表達明顯減少(P<0.01)，中藥中劑量組TSP-1 蛋白表達也減少(P<0.05)，中藥小劑量組 TSP-1 蛋白表達與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2及圖3。

表2 各組小鼠主動脈TSP-1蛋白表達比較(±s)

與空白組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△ P<0.01。圖3 各組小鼠主動脈TSP-1蛋白表達情況

2.3 各組小鼠血小板CD36表達率比較 與空白組比較，模型組血小板CD36表達率明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，立普妥組與中藥大劑量組血小板CD36表達率明顯降低(P<0.05)。中藥中劑量組、中藥小劑量組CD36表達率與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表3及圖4、圖5。

表3 各組小鼠血小板CD36表達率比較(±s) 單位：%

圖4 流式細胞儀檢測各組小鼠CD36表達率水平結果(A為空白組；B為模型組；C為立普妥組：D為中藥大劑量組；E為中藥中劑量組；F為中藥小劑量組)

與空白組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖5 各組小鼠CD36表達率柱狀圖

2.4 各組小鼠血小板活化率比較 與空白組比較，模型組血小板活化率明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，立普妥組與中藥大劑量組血小板活化率明顯降低(P<0.05)。中藥中、小劑量組血小板活化率與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表4及圖6、圖7。

表4 各組小鼠血小板活化率比較(±s) 單位：%

圖6 流式細胞儀檢測各組小鼠血小板活化率結果(A為空白組；B為模型組；C為立普妥組：D為中藥大劑量組；E為中藥中劑量組；F為中藥小劑量組)

與空白組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖7 各組小鼠血小板活化率柱狀圖

3 討 論

血小板活化與聚集對血栓形成至關重要[8]，在血管內皮受損及血流剪切力改變時，血小板黏附、活化和聚集發生，導致血栓形成。血小板活化會刺激細胞因子大量釋放，而釋放的細胞因子又會介導早期血管反應，使血小板活化加速，并促進黏附分子表達以及巨噬細胞的募集[9-10]。活化血小板釋放的主要蛋白包括TSP-1[11]，可刺激血管內皮細胞凋亡繼而抑制血管新生，并可保護血管性血友病因子(vWF)遭裂解，以及介導血小板的黏附、聚集，參與血栓形成的過程，從而促進動脈粥樣硬化的形成。當血管損傷時，受損部位有大量的TSP-1聚集，這些TSP-1是由活化的血小板所釋放，誘導鈣調素(CAM)表達，促使單核細胞黏附明顯增加[12]。除此以外，內皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和血管平滑肌細胞(VSMCs)等多種細胞也可分泌TSP-1[11]。與胚胎比較，健康成年人組織 TSP-1蛋白表達較少[13]。但當組織損傷時，細胞會提高 TSP-1 蛋白表達來促進組織修復[14]，動脈粥樣斑塊中TSP-1 蛋白表達明顯高于健康血管[15]。血小板表面存在 TSP-1的受體CD36，TSP-1可與血小板表面的CD36結合來抑制血管性血友病因子裂解，這一過程能加速血小板活化[16]；另一方面，TSP-1也可能通過抑制 CD36介導的環磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路或阻斷一氧化氮(NO)/環磷酸鳥苷(cGMP)信號的抗血栓活性來間接介導血小板活化[17]。CD36還是一種雙跨膜蛋白[18]，與氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、TSP-1、氧化磷脂(oxPL)和長鏈脂肪酸有一些共同的結合位點[19-20]，阻斷CD36或酪氨酸激酶可抑制 TSP-1 或氧化型低密度脂蛋白的血小板信號反應。既往研究證實，在血小板活化過程中out-in 信號的觸發，與TSP-1和氧化型低密度脂蛋白密切相關，而在其中起主要連接作用的就是CD36[21]。在血小板活化過程中，血小板分泌作用的擴大與整聯蛋白活化密不可分，而上述反應由CD36所介導，并被血小板自分泌產生的 二磷酸腺苷(ADP)所增強，進而加速血栓形成[22]。在血栓形成過程中，血小板活性增強的同時，伴隨著血管內皮功能紊亂，鐘慧等[23]研究發現，心肌梗死發病時，血漿中NO分泌受抑制而內皮素-1(ET-1)濃度過高，使用活血化瘀中藥注射劑可有效促進梗死后心功能的恢復和心肌組織損傷修復。而Ds和Dd與動脈粥樣硬化程度密切相關，高輝等[24]研究發現，活血化瘀中成藥可明顯改善肱動脈靜息時基礎內徑、反應性充血后內徑及血管內皮舒張功能(FMD)、踝臂脈搏波傳導速度(BaPWV)。

本研究使用超聲影像系統檢測小鼠腹主動脈Ds及Dd變化，發現模型組Ds及Dd明顯減小。與模型組比較，立普妥組與中藥大劑量組Ds及Dd明顯增大，考慮與動脈粥樣硬化所致管腔狹窄和內皮功能紊亂有關。與空白組比較，模型組主動脈TSP-1 蛋白表達、血小板活化率及CD36表達水平均增高，證明動脈粥樣硬化加重時，TSP-1蛋白表達和CD36表達上調，并促進血小板的活化。而立普妥組與中藥大、中劑量組對TSP-1蛋白表達、血小板 CD36表達率及血小板活化率均有下調。TSP-1表達升高與血小板活化均能夠加速動脈粥樣硬化形成。因此，騏龍血脈健方可能通過下調 TSP-1 蛋白的表達，減少血小板CD36水平并且抑制血小板活化的過程，最終達到抗動脈粥樣硬化的作用。