5-HT2B受體拮抗劑通過調控ERK通路干預大鼠垂體瘤纖維化的作用機制

王明國，饒克成，喬卿均，高 飛

垂體瘤是起源于腺垂體、神經垂體及胚胎期顱咽管殘余鱗狀上皮的腫瘤，在顱內良性腫瘤中較為常見，占10%～12%，病人主要表現為頭痛、惡心、嘔吐、視力減退等[1-2]。臨床上，大部分垂體瘤病人采用手術治療可以治愈，且不影響自然壽命，少部分病人經手術無法治愈的原因在于垂體瘤纖維化程度較高，病灶質地堅韌，無法徹底切除。有研究表明，垂體腺瘤質地與纖維化程度密切相關[3]。纖維化是指機體組織、器官纖維結締組織過度形成的病理過程，其中，成纖維細胞可參與合成大量細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，其主要成分為膠原蛋白，可促進組織、器官纖維化進程[4]。正常情況下，ECM產生和分解處于平衡狀態，而病理情況下，ECM含量異常升高，從而導致組織器官纖維化，引起實質功能下降[5]。有研究表明，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)2B受體可以誘導成纖維細胞增殖，促進纖維化發生，對5-HT2B受體信號進行抑制，可以減輕纖維化程度，從而達到治療目的[6-7]。本實驗通過建立垂體瘤大鼠模型，并采用不同方式作用于5-HT2B受體，明確對垂體瘤纖維化的影響，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只7周齡無特定病原體(SPF)級健康SD雌性大鼠(中山大學實驗動物中心)，體質量(180±20)g，生產許可證號：SCXK(粵)2016-0029，適應性飼養1周。

1.2 實驗試劑及儀器 5-HT2B受體激動劑(美國APExBIO Technology公司生產，BW723C86)，5-HT2B受體拮抗劑(美國Gene Operation公司生產，SB204741)，兔抗大鼠轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)一抗(美國Bioworld Technology公司)，兔抗大鼠結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、一抗(武漢博士德生物工程公司)，兔抗大鼠細胞外調蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)一抗(北京博奧森生物技術有限公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(上海碧云天生物技術有限公司)，超聲診斷儀(徐州貝爾斯電子科技有限公司)，DYS-40顯微鏡(購自上海點應光學儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及建模 選取45只大鼠，以雌激素建立垂體瘤模型[8]：大鼠皮下埋置10 mg雌激素微量緩釋泵，誘導垂體瘤模型，8周后，通過彩超觀察大鼠體內垂體瘤形成情況，若無明顯腫瘤形成，則更換緩釋泵繼續干預4周，第12周經彩超觀察均建模成功。將建模成功大鼠分為模型組、5-HT2B受體拮抗劑組、5-HT2B受體激動劑組，各15只，剩余15只大鼠為對照組，皮下埋置10 mg生理鹽水微量緩釋泵。

1.3.2 干預方法 建模成功后24 h，5-HT2B受體拮抗劑組、5-HT2B受體激動劑組大鼠分別用2 mg/kg SB204741、2 mg/kg BW723C86腹腔注射，對照組及模型組腹腔注射等量生理鹽水，每天2次，共14 d，期間大鼠自由進食、飲水，干預結束后，無大鼠死亡。

1.3.3 測量垂體腫瘤最大直徑、體積及體質量 末次干預結束后2 h，腹腔注射2%戊巴比妥麻醉大鼠，頸部備皮消毒，作頸正中切口。經鈍性分離，暴露胸骨舌骨肌，由其外緣分離肌肉層至找到枕骨嵴，分離枕蝶縫合，調節鉆顱針長度，于枕骨嵴及枕蝶縫合交點處垂直鉆孔，待骨板鉆通，取出骨板，挑破垂體腦膜，用連接1/8馬力吸引器的玻璃管吸出垂體。測量腫瘤最大直徑，并通過腫瘤最大徑(d1)、垂直方向最小徑(d2)計算各組垂體瘤體積，并對垂體稱重。垂體瘤體積V=π/2×d1×(d2)2。

1.3.4 蘇木精-伊紅(HE)染色 測量結束后，將各組大鼠1/2垂體組織于-80 ℃保存。剩余部分置于4%的甲醛中固定72 h，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋并切片，厚度4 μm。蘇木素染色4 min，1%鹽酸乙醇分化20 s，1%氨水返藍30 s，伊紅染色90 s，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察垂體組織病理變化。

1.3.5 Masson染色 取垂體組織切片，二甲苯脫蠟，乙醇沖洗，滴加Weigert鐵蘇木素染色10 min，水洗后用1%鹽酸乙醇分化10 s，麗春紅酸性復紅液染色10 min，蒸餾水沖洗，1%磷鉬酸水溶液處理5 min，苯胺藍復染5 min，1%冰醋酸處理1 min，水洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察垂體組織膠原分布情況。

1.3.6 逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測 取凍存垂體組織200 mg，Trizol法提取總RNA，反轉錄cDNA，后進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。PCR體系：2×Mix 6 μL，cDNA 2 μL，正向、反向引物各1 μL，超純水15 μL，共25 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，循環數35個，60 ℃終延伸10 min。利用相對定量2-△△Ct法評估各個目的基因mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測 取垂體組織200 mg，加入RIPA裂解液，離心后取上層清液，進行蛋白定量。上樣，進行凝膠電泳。電泳結束后，轉膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入TGF-β1、CTGF、ERK1/2、p-ERK1/2一抗(1∶500)，4 ℃環境下孵育過夜，洗膜，加入相應的二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL化學反應液，曝光后顯影，測定蛋白條帶灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，目的蛋白/內參蛋白條帶比值為目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組垂體瘤直徑、體積及垂體質量比較 各組大鼠垂體瘤最大直徑、體積及垂體質量組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，5-HT2B受體拮抗劑組垂體瘤最大直徑、體積及垂體質量均下降(P<0.05)，5-HT2B受體激動劑組垂體瘤最大直徑、體積及垂體質量均升高(P<0.05)；與5-HT2B受體拮抗劑組比較，5-HT2B受體激動劑組垂體瘤最大直徑、體積及垂體質量均升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組垂體瘤最大直徑、體積及垂體質量比較(±s)

2.2 各組垂體組織病理變化 HE染色結果顯示，對照組垂體細胞數目較多，多為圓形，排列整齊有序，血竇豐富，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠垂體細胞有瘤樣改變，細胞數量明顯增多，呈圓形或多角形，胞核大小不一，血竇數量明顯減少，細胞間質增生明顯，可見毛細血管增生，有炎性細胞浸潤；5-HT2B受體拮抗劑組大鼠垂體細胞有瘤樣改變，細胞數量較少，偶有間質增生現象，炎性反應較輕；5-HT2B受體激動劑組大鼠垂體細胞數量大量增多，核大且核仁明顯，血竇數量明顯減少，細胞間質增生現象嚴重，大量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組垂體組織病理變化HE染色圖(×400)

2.3 各種垂體組織膠原分布情況 Masson染色結果顯示，對照組垂體細胞較多，分布均勻，無膠原產生；模型組可見不連續膠原纖維，分布密集，并可見結節；5-HT2B受體拮抗劑組偶有稀疏、散在分布膠原，無連續膠原纖維，結節較少；5-HT2B受體激動劑組，膠原纖維較多且連續，呈片狀，結節較多。詳見圖2。

圖2 各組垂體組織膠原分布Masson染色圖(×400)

2.4 各組TGF-β1、CTGF、ERK1/2 mRNA相對表達情況比較 各組大鼠垂體組織中TGF-β1、CTGF mRNA相對表達量組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、5-HT2B受體拮抗劑組及5-HT2B受體激動劑組TGF-β1、CTGF mRNA相對表達量均升高(P<0.05)；與模型組比較，5-HT2B受體拮抗劑組TGF-β1、CTGF mRNA相對表達量均降低，5-HT2B受體激動劑組TGF-β1、CTGF mRNA相對表達量均升高(P<0.05)；與5-HT2B受體拮抗劑組比較，5-HT2B受體激動劑組TGF-β1、CTGF mRNA相對表達量均升高(P<0.05)。對照組、模型組、5-HT2B受體拮抗劑組及5-HT2B受體激動劑組ERK1/2 mRNA相對表達量組間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組垂體組織TGF-β1、CTGF、ERK1/2 mRNA相對表達情況比較(±s)

2.5 各組TGF-β1、CTGF、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達情況比較 各組大鼠垂體組織中TGF-β1、CTGF、p-ERK1/2蛋白相對表達量組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組、5-HT2B受體拮抗劑組及5-HT2B受體激動劑組TGF-β1、CTGF、p-ERK1/2蛋白相對表達量均升高(P<0.05)；與模型組比較，5-HT2B受體拮抗劑組TGF-β1、CTGF、p-ERK1/2蛋白相對表達量均降低(P<0.05)，5-HT2B受體激動劑組TGF-β1、CTGF、ERK1/2、p-ERK1/2均升高(P<0.05)；與5-HT2B受體拮抗劑組比較，5-HT2B受體激動劑組TGF-β1、CTGF、p-ERK1/2蛋白相對表達量均升高(P<0.05)。對照組、模型組、5-HT2B受體拮抗劑組及5-HT2B受體激動劑組ERK1/2蛋白相對表達量組間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表4、圖3。

表4 各組垂體組織中TGF-β1、CTGF、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白相對表達量比較(±s)

圖3 各組垂體組織中TGF-β1、CTGF、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達條帶圖

3 討 論

據相關資料統計，各類疾病致死的病人中，大約45%都與組織器官纖維化有關[9]。纖維化是病理性過程，可發生在包括心臟、肺臟、胰臟、神經系統等在內的多個器官內，是多種慢性疾病及腫瘤的標志，不但使組織、器官功能下降，還可能因器官結構破壞、功能衰竭引發死亡[10-11]。5-HT是一種促纖維化生長因子，可促進成纖維細胞、成骨細胞、神經細胞等多種細胞生長，其生物學功能主要通過不同類型受體及亞型實現，5-HT2B受體與神經系統病理生理過程關系密切[12]。有研究表明，5-HT2B受體拮抗劑可通過抑制相關通路，起到抗增殖作用，從而減輕肺纖維化程度[13]。本實驗通過對5-HT2B受體進行干預，為抑制垂體瘤纖維化提供新型治療方案。

當機體損傷較大或反復出現超出細胞自身再生能力時，間質結締組織大量增生會對缺損區域進行修復，以維持組織器官相對完整性。膠原過度沉積是垂體瘤纖維化的顯著特征，減少膠原沉積可一定程度抑制瘤體纖維化，抑制腫瘤增長。5-HT2B受體位于動物神經細胞及其他類型細胞膜上，介導血清素作為內源性配體，參與神經傳導物質的傳遞，其可通過激活分裂-纖維化途徑，參與垂體及垂體腺瘤纖維化的形成。有研究表明，當5-HT2B受體作用被抑制，成纖維細胞分化能力降低，組織纖維化進程受到抑制[14]。Janssen等[15]研究顯示，SB204741作為5-HT2B受體拮抗劑的一種，可減少膠原蛋白沉積，抑制右心室纖維化，通過慢性治療可以阻止因壓力超負荷誘導引起的心臟功能衰竭的發生。本研究分別采用5-HT2B受體激動劑BW723C86和5-HT2B受體拮抗劑SB204741干預成模大鼠，結果顯示，與模型組比較，5-HT2B受體拮抗劑組垂體瘤最長直徑、體積及垂體質量均降低，5-HT2B受體激動劑組均升高；同時膠原沉積以對照組最少，5-HT2B受體拮抗劑組次之，5-HT2B受體激動劑組最高，表明5-HT2B受體拮抗劑可以減少膠原沉積，抑制垂體瘤增長，與既往研究結果相符。

細胞外調蛋白激酶(ERK)與腫瘤侵襲、轉移過程有關，通過下調ERK相關信號通路，可降低間皮瘤纖維化程度[16-17]。TGF-β1參與組織損傷修復，當損傷因素持續存在時，使ECM異常沉積，造成組織器官功能障礙[18]。此外，TGF-β1還可通過誘導CTGF表達，促進ERK磷酸化，誘導成纖維細胞增殖，從而促進纖維化病變的發生。有研究表明，通過影響ERK信號傳導過程，可抑制TGF-β1誘導的上皮-間質轉化，減弱肺纖維化程度[19]。Hori等[20]研究顯示，5-HT2B受體在缺乏血管和神經元的軟骨組織中表達，可在軟骨發育和再生過程中發揮功能，通過5-HT2B受體激動劑處理可增加ERK1/2的磷酸化，從而加快纖維化進程。而5-HT2B受體拮抗劑則通過阻斷TGF-β1介導的ERK途徑，抑制成纖維細胞的促纖維化，從而影響硬皮病的發生、發展過程[7]。本研究結果顯示，與模型組比較，5-HT2B受體拮抗劑組大鼠垂體組織中TGF-β1、CTGF mRNA及TGF-β1、CTGF、p-ERK1/2蛋白表達降低，5-HT2B受體激動劑組均升高，表明5-HT2B受體拮抗劑可減少TGF-β1、CTGF表達，從而抑制ERK通路磷酸化活化，影響ERK信號傳導過程，從而減輕垂體纖維化程度。

綜上所述，5-HT2B受體拮抗劑可減輕垂體瘤大鼠垂體組織纖維化程度，抑制腫瘤增長，可能與抑制ERK相關通路有關，為臨床垂體瘤治療提供參考。