腦膠質(zhì)瘤組織中蘋(píng)果酸酶2、MMP-2的陽(yáng)性表達(dá)及其臨床意義

陳 俊，李軍烽，鄭 樂(lè)

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是起源于神經(jīng)上皮組織的惡性腫瘤，包括星形膠質(zhì)、少枝膠質(zhì)、室管膜等組織的腫瘤[1-2]。膠質(zhì)細(xì)胞瘤約占顱內(nèi)腫瘤的40%。發(fā)病率較高，且由于其惡性增殖、侵襲性生長(zhǎng)等特點(diǎn)，復(fù)發(fā)率、死亡率高，預(yù)后差[3-4]。臨床上無(wú)論是采取放化療還是手術(shù)治療，都難以完全治愈。蘋(píng)果酸酶2(ME2)可誘發(fā)細(xì)胞衰老，并調(diào)控細(xì)胞的代謝和增殖，促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)展，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的重要酶類，影響細(xì)胞的代謝、存活、遷移、增殖和分化[6]。目前已有部分關(guān)于MMP-2與腦膠質(zhì)瘤的研究。本研究旨在探討腦膠質(zhì)瘤組織中ME2、MMP-2的陽(yáng)性表達(dá)及臨床意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年6月—2020年6月在我院行腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除術(shù)的97例病人(腦膠質(zhì)瘤組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未進(jìn)行過(guò)放化療，并通過(guò)術(shù)后影像學(xué)和病理學(xué)檢查確診為腦膠質(zhì)瘤[7]；②無(wú)其他精神外科疾??；③簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②精神及心理狀態(tài)異常；③心、肝、腎重要器官功能不全；④心腦血管系統(tǒng)疾病。通過(guò)《世界衛(wèi)生組織2016中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)97例腦膠質(zhì)瘤手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)15例，Ⅱ級(jí)32例，Ⅲ級(jí)27例，Ⅳ級(jí)23例。并選取同期在我院行顱腦損傷去骨瓣內(nèi)減壓術(shù)病人25例作為對(duì)照組，病人術(shù)后通過(guò)病理檢查確定為正常腦組織，腦膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)增生、壞死情況。

1.2 試劑 鼠抗人ME2單克隆抗體(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)，鼠抗人MMP-2單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司)。

1.3 免疫組化學(xué)染色二步法 收集兩組病人全部腦組織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)10%中性甲醛標(biāo)本固定液進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切取5張4 μm的厚片，依次編碼。將所有標(biāo)本進(jìn)行石蠟切片，脫蠟、水化，經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)后使用微波高火5 min直至其沸騰，置于室溫下冷卻，使用3%H2O2去離子水進(jìn)行孵育10 min，將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次，每次2 min，分別滴加ME2、MMP-2一抗(1∶300稀釋)，置于4 ℃的環(huán)境過(guò)夜。PBS沖洗3次，每次2 min，滴加聚合物輔助劑，置于室溫下進(jìn)行10～20 min的孵育；PBS沖洗3次，每次2 min，再滴加辣根酶標(biāo)記抗鼠/兔/山羊IgG聚合物，置于室溫下進(jìn)行10～20 min的孵育；PBS沖洗3次，每次2 min，使用二氨基聯(lián)苯胺溶液進(jìn)行2～5 min的顯色；自來(lái)水沖洗干凈后，使用蘇木素復(fù)染1～2 min，脫水、透明、封片。對(duì)照組使用PBS代替一抗。

結(jié)果判定方法：在400倍光鏡下，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性染色細(xì)胞情況，陽(yáng)性細(xì)胞率=(陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)/1 000)×100%。比較兩組ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率。

2 結(jié) 果

2.1 兩組腦組織標(biāo)本ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率比較 腦膠質(zhì)瘤組不同病理分級(jí)腦組織標(biāo)本ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率均高于對(duì)照組(P<0.05)，ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率隨著病理分級(jí)的增加逐漸升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組腦組織標(biāo)本ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率比較(±s) 單位：%

2.2 低級(jí)別(Ⅰ級(jí)+Ⅱ級(jí))和高級(jí)別(Ⅲ級(jí)+Ⅳ級(jí))腦膠質(zhì)瘤ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率比較 Ⅲ級(jí)+Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于Ⅰ級(jí)+Ⅱ級(jí)腦膠質(zhì)瘤(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 Ⅰ級(jí)+Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)+Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率比較(±s) 單位：%

2.3 腦膠質(zhì)瘤中ME2、MMP-2與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同性別、年齡、頭暈情況、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞種類、腦膠質(zhì)瘤部位的ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞檢出率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，不同腫瘤大小、病理級(jí)別的ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 腦膠質(zhì)瘤中ME2、MMP-2與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 單位：%

2.4 腦膠質(zhì)瘤中ME2、MMP-2和臨床病理分級(jí)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤中ME2、MMP-2的表達(dá)與臨床病理分級(jí)呈正相關(guān)(r=0.751，P<0.05；r=0.680，P<0.05)。

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤，是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。在原發(fā)性腦瘤中，膠質(zhì)瘤治療難度大，致殘率、致死率極高。腦膠質(zhì)瘤可導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高和神經(jīng)功能缺失，表現(xiàn)為頭痛、惡心、嘔吐、視乳頭水腫、失語(yǔ)、運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)障礙和復(fù)視等，也有部分病人是以癲癇發(fā)作及意識(shí)障礙起病[8-9]。目前臨床對(duì)于腦膠質(zhì)瘤以手術(shù)治療為主，最大范圍地安全切除腫瘤組織，輔以放療和化療，提高病人生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期[10-11]。

世界衛(wèi)生組織根據(jù)腫瘤的惡性程度不同，將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，其中Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，包括毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤、彌漫性星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤等；Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤，包括間變性星形細(xì)胞瘤、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、間變性少突星形細(xì)胞瘤等[12-13]。MMP-2是由多種細(xì)胞分泌的明膠酶，由體內(nèi)多種細(xì)胞合成和分泌，包括成纖維細(xì)胞、星形細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[14-15]。MMP-2能夠降解多種細(xì)胞外基質(zhì)，在人體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理和病理功能，具有降解變性的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原的能力，也可切割天然Ⅳ型、Ⅴ型膠原。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2能破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用[16-17]。ME2屬于蘋(píng)果酸酶3個(gè)亞型中的一種，具有高度保守的序列和拓樸結(jié)構(gòu)，屬于機(jī)體細(xì)胞代謝過(guò)程中的氧化脫羧酸，其代謝產(chǎn)物為丙酮酸，并誘發(fā)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，并在細(xì)胞再生過(guò)程中開(kāi)始把葡萄糖成分氧化成二氧化碳，并產(chǎn)生三磷酸腺苷作為細(xì)胞燃料，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)能量的需求。于學(xué)娟等[18]研究指出ME2在多種人體惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，使黏附因子的表達(dá)受到抑制，從而增加腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，使其從原發(fā)腫瘤病灶上脫離，形成游離細(xì)胞破壞細(xì)胞外基質(zhì)，從而使腫瘤細(xì)胞突破結(jié)締組織構(gòu)成的屏障。

本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組不同病理分級(jí)腦組織標(biāo)本ME2、MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞率均高于對(duì)照組(P<0.05)，隨著腦膠質(zhì)瘤臨床病理分級(jí)的增高，其陽(yáng)性細(xì)胞率也隨之升高，且ME2、MMP-2表達(dá)與臨床病理分級(jí)呈正相關(guān)，提示ME2、MMP-2和疾病嚴(yán)重程度存在著密切關(guān)系。由于腫瘤細(xì)胞的能量代謝途徑與正常細(xì)胞有所不同，主要依賴于糖酵解而不是氧化磷酸化途徑。ME2能夠催化蘋(píng)果酸生成丙酮酸，使糖酵解作用增強(qiáng)，加速了糖酵解途徑，提示ME2可能是促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞增殖和發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要蛋白[19-20]。MMP-2釋放生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，形成腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的運(yùn)行通道，從而導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞突破結(jié)締組織構(gòu)成的屏障[21-22]。此外，MMP-2通過(guò)加速對(duì)血管生成因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的合成與分泌，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤血管的形成[19，23-24]。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，在腦膠質(zhì)瘤組織中ME2、MMP-2與臨床病理分級(jí)呈正相關(guān)，對(duì)于ME2、MMP-2與腦膠質(zhì)瘤之間的關(guān)系仍需結(jié)合其他醫(yī)療中心進(jìn)行長(zhǎng)效性的研究。

綜上所述，ME2、MMP-2在腦膠質(zhì)瘤病人組織中有明顯高表達(dá)，與臨床病理分級(jí)有明顯相關(guān)性，為研究腦膠質(zhì)瘤的病理機(jī)制提供新思路。