不同香型白酒大曲微生物群落及其與風味的相關性

張清玫，趙鑫銳,2,3，李江華,2,3，堵國成,2,3，陳堅,2,3*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學, 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，不同白酒酒體風格迥異，可分為多種香型，其中醬香型、濃香型和清香型是白酒的基本香型[1]。影響白酒香型的因素諸多，除地域環境與釀造工藝等因素外，大曲對白酒風味的形成也做出了重要貢獻。白酒大曲是白酒釀造所需的發酵劑和生香劑，為白酒釀造提供了豐富的微生物、酶和風味物質及其前體，不同香型的大曲為其對應白酒的釀造過程提供了不同的功能菌群，并在產香能力與產香種類方面存在一定的差異[2]。因此有必要研究不同香型大曲中微生物群落功能和風味組成差異以及兩者之間的內在聯系。

近年來，隨著組學技術的快速發展，對于大曲中微生物的研究已經不再局限于傳統可培養技術[3]。研究者們借助擴增子測序研究了不同時期[4]、等級[5]、季節[6]的大曲，揭示了大曲微生物組成并基于關聯性分析發現大曲在發酵過程中微生群落受到發酵時間、溫度、濕度等影響。ZANG等[7]、XU等[8]分別通過發酵微生物群落與發酵風味的關聯性分析，探索了發酵魚和辣椒發酵過程中產香核心功能菌群。HUANG等[9]、WANG等[10]也以風味為導向探索了白酒釀造過程中的產香核心功能菌群。然而，擴增子測序缺乏功能基因的具體信息，使得進一步深入研究面臨瓶頸。相比之下宏基因組測序在一定程度上彌補了這些缺陷[11]，可以更系統深入地研究微生物群落結構及其功能基因，全面分析其組成、變化規律、親緣進化并挖掘出潛力豐富的功能基因，從而進一步揭開發酵食品微生物群落的神秘面紗[12]。

本研究選取了3種香型白酒大曲，基于宏基因組學技術對3種酒曲中微生物群落結構和功能基因進行研究，采用了頂空固相微萃取氣質聯用(headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry)方法解析了大曲中風味物質，并對大曲核心菌群以及特征風味進行了關聯性分析。以此探索微生物和風味之間的關系，以及各自的關鍵產香功能微生物，這對于在微觀層面了解3種香型大曲的差異原因，以及穩定和改善白酒大曲風味和品質從而保證不同香型白酒主體香突出具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大曲樣品：醬香型白酒大曲HT,四川省某酒廠；濃香型白酒大曲MT，江蘇省某酒廠；清香型白酒大曲LT，山西省某酒廠。

主要試劑：磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀，均為分析純，中國醫藥集團有限公司；DNeasy PowerSoil Pro Kit，QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

電泳儀、Gel Doc 凝膠成像系統，美國 Bio-Rad 公司；臺式高速離心機，德國 Eppendorf 公司；氣相色譜質譜聯用儀SCIONSQ-456-GC，美國布魯克公司；Illumina HiSeq4000測序平臺，美國Illumina 公司。

1.3 DNA提取

稱取5 g大曲樣品，加入15 mL PBS緩沖液于50 mL 的離心管中，加入玻璃珠3顆，充分振蕩5 min后以離心力150×g離心5 min，取上清液于離心管中。再向沉淀中加入5 mL PBS緩沖液重復洗兩次，150×g離心5 min，收集上清液。將收集的上清液10 000×g離心10 min，收集菌體沉淀，后參照QIAGEN公司DNeasy PowerSoil Pro Kit試劑盒說明書提取DNA。提取得到的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法進行質量和濃度檢測。質檢合格的樣本樣品貯存在-20 ℃以備后續實驗使用。

1.4 宏基因組測序

1.4.1 建庫測序

檢測合格的DNA樣品用Covaris超聲波破碎儀將基因組DNA隨機打斷成長度約300 bp左右的小片段，經末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至2 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對文庫的插入片段進行檢測，插入片段符合預期后，使用qPCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度3 nmol/L)，以保證文庫質量。文庫質檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后在Illumina HiSeq4000平臺測序。

1.4.2 數據分析處理

對原始下機數據使用Trimmomatic軟件進行質控，包括去除接頭序列、低質量reads。(1) 過濾帶有測序接頭的reads；(2) 過濾N(不確定堿基)含量比例>1%的reads；(3) 過濾低質量堿基(Q20)含量>50%的reads。并過濾質控后片段長度仍<150 bp的reads。質控后將得到的高質量序列clean reads使用DIAMOND BLASTX算法進行比對和物種注釋，使用組裝軟件MEGAHIT (v1.0.6) 對測序數據進行組裝，并過濾掉組裝結果中500 bp以下的片段。采用prodigal軟件對組裝得到的contig序列進行ORF (Open Reading Frame) 預測，使用CD-HIT軟件對預測的結果去冗余，從而得到非冗余基因集。采用Bowtie軟件將測序數據與構建的非冗余基因集進行比對，并統計單個基因在不同樣本的豐度信息。將預測得到非冗余基因集與功能注釋數據庫NR、KEGG進行比對和注釋。

1.5 HS-SPME-GC-MS解析大曲揮發性物質

1g大曲樣品與內標10 μL 2-辛醇 (10 mg/L) 混合，用SPME纖維(50∶30 mm二乙烯基苯-羧基-聚二甲基硅氧烷)在60 ℃下萃取30 min。在DB-Wax色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)上進行化合物的分離。氦氣以0.8 mL/min的恒定流速用作載氣。在40 ℃下保持3 min，以6 ℃/min到100 ℃，然后以10 ℃/min到230 ℃，并保持6 min。質譜儀以電子碰撞模式操作，電子能量設置為70 eV，掃描范圍為33～400m/z。MS源和四級桿的溫度分別設置為200 ℃和230 ℃。使用美國國家標準與技術研究所 (National Institute of Standards and Technology, NIST) 和Wiley數據庫鑒定每種化合物。選擇正負匹配度>800的化合物。根據內標峰面積與風味物質峰面積的比值，計算出大曲揮發風味的相對濃度。

1.6 核心微生物與差異風味的關聯性分析

將偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)得到的變量重要性投影 (variable Importance for the projection,VIP)值>1的風味物質和每種大曲豐度前3以及線性判別分析 (linear discriminant analysis，LDA)值>3.5的細菌屬和真菌屬作為變量，通過R語言批量計算變量之間的Spearman相關系數，選取微生物與風味成分之間相關性系數絕對值>0.6且相關性顯著 (P<0.05) 的部分進行關聯網絡可視化。使用Cytoscape對大曲微生物與風味成分的相關性和微生物之間的互作關系進行可視化。

2 結果與分析

2.1 三種香型大曲微生物結構差異分析

對3種香型大曲的微生物群落進行物種注釋。首先對其進行多樣性差異分析，由圖1-a可知，3種大曲中，清香型大曲的細菌多樣性與豐富度最高，而濃香型大曲細菌群落的豐富度與多樣性均顯著低于其他兩種曲(P<0.05)。醬香型大曲的真菌多樣性與豐富度都顯著高于其他兩種曲(圖1-b,P<0.05)，清香型大曲的真菌多樣性最低而濃香型大曲的真菌豐富度最低。基于主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)可知(圖1-c～圖1-d)，3種大曲無論在細菌群落結構還是真菌群落結構上都存在著顯著的差異。

a-細菌α-多樣性分析；b-真菌α-多樣性分析；c-細菌β-多樣性分析；d-真菌β-多樣性分析圖1 三種香型大曲微生物多樣性分析Fig.1 Microbial diversity analysis of three types of Daqu

2.2 三種香型大曲微生物群落組成

3種香型大曲中主要注釋到3種細菌門，分別是Firmicutes，Actinobacteria和Proteobacteria，其中Firmicutes在濃香型大曲占據主導地位，其平均相對豐度總和>97%。在清香型大曲中Firmicutes，Actinobacteria占據主導地位，其平均相對豐度總和>99%。在醬香型大曲中Firmicutes，Actinobacteria和Proteobacteria占據主導地位，其平均相對豐度總和>99%，且Proteobacteria的豐度遠高于其他兩種大曲。同時主要注釋到兩種真菌門，Ascomycota和Mucoromycota，其相對豐度總和在3種大曲中均>99%，其中Ascomycota在醬香型大曲中的相對豐度最高而Mucoromycota在濃香型大曲中的相對豐度最高。

在屬水平上對3種香型大曲相對豐度前20的優勢細菌與優勢真菌進行分析，由圖2可知，Desmospora、Saccharopolyspora和Bacillus是醬香型大曲主要優勢細菌屬，Byssochlamys、Aspergillus、Rasamsonia和Lichtheimia是醬香型大曲的優勢真菌屬，通過線性判別分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)可知，細菌屬Desmospora、Saccharopolyspora和真菌屬Byssochlamys、Aspergillus、Rasamsonia是醬香型大曲的標記微生物屬 (LDA>3.5)；濃香型大曲微生物群落主要由優勢細菌屬Bacillus、Leuconostoc和優勢真菌屬Lichtheimia、Saccharomyces、Pichia組成，其標記微生物主要為Bacillus、Lichtheimia和Saccharomyces。清香型大曲的細菌群落組成較為均勻，其優勢菌屬的相對豐度差異較小，主要由Lactobacillus、Leuconostoc、Weissella、Streptomyces和Staphylococcus等產酸細菌屬組成，且是其標記微生物，而其真菌群落則主要由Pichia和Lichtheimia組成，其中Pichia是清香型大曲的標記真菌屬。

2.3 三種香型大曲微生物群落功能差異分析

基于KEGG數據庫對3種大曲的基因進行功能注釋，由圖3-a所示的二級代謝通路信息可知，3種大曲中參與Carbohydrate metabolism(碳水化合物代謝)與Amino acid metabolism(氨基酸代謝)的功能基因最多，在所有的代謝通路中所占比例最高，說明在大曲發酵過程中微生物對碳水化合物與氨基酸等物質的代謝活動較為旺盛。大曲原料富含淀粉與蛋白質，微生物在該類大分子原料的代謝降解中發揮了巨大的作用，其代謝產物如還原糖與氨基酸在滿足微生物自身生長代謝的同時，還可生成風味物質及其前體。在還原糖被微生物利用與轉化過程中伴生多種酸、醇和醛類物質，而氨基酸決定了酒的風味，在酒的香型及口感形成中起著重要作用[13]。同時還原糖與氨基酸在發酵過程中會發生美拉德反應從而形成風味物質，曲溫越高，該反應越易發生。3種大曲Carbohydrate metabolism(碳水化合物代謝)、Amino acid metabolism(氨基酸代謝)、Nucleotide metabolism(核苷酸代謝)、Metabolism of cofactors and vitamins(輔因子與氨基酸代謝)和Metabolism of other amino acids(其他氨基酸代謝)等與原料利用相關的代謝通路的比例均存在顯著的差異 (P<0.05)，其中清香型大曲微生物在碳水化合物代謝的比例顯著高于其他兩種大曲，醬香型大曲微生物在氨基酸代謝的比例相對最高。對代謝通路進一步分析，如圖3-b所示為豐度前30的三級代謝通路，如ABC transporters(ABC 轉運)、Biosynthesis of amino acids(氨基酸生物合成)和Carbon metabolism(碳代謝)等。通過單因素方差分析可知，3種大曲微生物在碳水化合物代謝中的Pyruvate metabolism(丙酮酸代謝)、Amino sugar and nucleotide sugar metabolism(氨基糖和核糖代謝)、Glycolysis/Gluconeogenesis(糖酵解/糖異生)、Starch and sucrose metabolism(淀粉和蔗糖代謝)、Citrate cycle(三羧酸循環)和Butanoate metabolism(丁酸鹽代謝)通路都存在顯著的差異，并且在清香型大曲中所占的比例高于其他2種大曲。3種大曲在氨基酸代謝中的Alanine, aspartate and glutamate metabolism(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝)和Glycine, serine and threonine metabolism(甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝)通路上同樣存在顯著差異，前者在清香型大曲中所占比例高于其他2種大曲，后者在醬香型大曲中所占比例最高。

a-優勢細菌屬；b-細菌屬LEfSe分析；c-優勢真菌屬；d-真菌屬LEfSe分析圖2 三種香型大曲優勢微生物與標記微生物Fig.2 Dominant and marker microorganisms of three types of Daqu

2.4 三種香型大曲揮發性代謝物質組成分析

從三種大曲中總共檢測出60種揮發性化合物，由圖4-a可知，醬香型大曲、濃香型大曲和清香型大曲中分別檢測到32、50和39種物質，其中3種大曲共有的物質有21種，濃香型特有的風味最多有10種。所有化合物主要分為六大類，包括5種酸類物質、5種酮類物質、7種醛類物質、11種吡嗪類物質、21種酯類物質和11種醇類物質(圖4-c)。如圖4-b所示，酯類物質、吡嗪類物質和醇類物質在大曲揮發性物質組成中均占主導地位，其中清香型大曲中的酯含量最高，濃香型大曲次之，醬香型大曲則相對最少。之前的報告中也發現清香型白酒的酯含量較高[14]。濃香型大曲中的吡嗪類物質濃度總和高于醬香型大曲和清香型大曲(圖4-b)，從已有報道中，同樣發現了濃香型大曲中含有豐富的吡嗪類物質[15]。白酒中的四甲基吡嗪主要由Bacillus生成的乙偶姻與銨鹽經化學反應而成[16]，在2.2中也發現濃香型大曲中Bacillus的含量高于另外2種大曲。根據半定量得到的風味物質濃度繪制了熱圖，發現醬香型大曲優勢風味物質種類數量最少，主要集中在酸、醇和吡嗪，這與之前在研究醬香型白酒風味時發現其有機酸總量明顯高于濃香型及清香型白酒是一致的[17]。清香型大曲優勢風味物質主要集中在酯類和醇類，并且只在清香型大曲中發現了乳酸乙酯，這與之前報道的乳酸乙酯是清香型白酒的特征風味相符合[18]。乳酸乙酯的關鍵前體是乳酸[19]，乳酸是乳酸菌的重要產物，乳酸菌在大曲較為常見，因此推測清香型大曲中乳酸菌對乳酸乙酯的生成與積累具有一定的正向作用。并且，乳酸自身也可以減少白酒的刺激性氣味，使白酒具有回甜感，增加白酒的風味[20]。濃香型大曲的優勢風味數量最多，主要集中在吡嗪和酯類，且濃香型大曲含有的酯類和吡嗪類的種類是最為豐富的。

a-3種大曲優勢二級代謝通路；b-3種大曲優勢三級代謝通路圖3 三種香型大曲基于KEGG數據庫的二級和三級代謝功能分析Fig.3 KEGG analysis of gene expression on first and second level of three types of Daqu

a-3種大曲代謝物VENN圖；b-3種大曲各類物質含量；c-3種大曲主要代謝物質熱圖分析圖4 三種香型大曲揮發性物質組成Fig.4 The flavor composition of the three types of Daqu

2.5 三種香型大曲典型風味物質解析

利用PLS-DA解析3種香型大曲代謝組成差異。PLS-DA得分圖(圖5-a，Q2>0.95)顯示，9個樣品根據其香型各自聚為3類，表明不同香型大曲之間的代謝物組成具有顯著差異。由VIP圖可知共有11種代謝物對該模型的代謝組成差異做出了重要貢獻(圖5-c，VIP值>1)，結果表明四甲基吡嗪、乙酸乙酯、三甲基吡嗪和2，3-丁二醇是濃香型大曲區別于其他2種香型大曲代謝組成的典型風味物質。己酸乙酯、十七酸乙酯、辛酸乙酯、庚醇和庚酸乙酯是清香型區別于其他2種香型大曲代謝組成的典型風味物質。在前面的KEGG注釋中，也發現清香型大曲丁酸鹽代謝通路顯著高于另外2種大曲，丁酸作為己酸的前體，丁酸的積累也為己酸乙酯的合成提供了基礎。盡管醬香型大曲中沒有顯著的代謝物，但在其中鑒定到8種特有物質，包括2-甲基丙酸、戊醇、癸醇和十三醇等風味物質。

a-PLS-DA的得分圖；b-PLS-DA的載荷圖；c-重要代謝物的VIP圖圖5 三種香型大曲代謝物差異分析Fig.5 Difference analysis of metabolites of three types of Daqu

2.6 微生物和風味物質關聯分析

在分析了3種香型大曲優勢、差異微生物和差異風味的基礎上，利用Spearman相關系數分析3種香型大曲優勢差異菌屬間與特征風味物質間的互作關系。若相關系數>0.6且P<0.05，則定義為具有顯著相關性。由圖6-a可知，己酸乙酯與庚酸乙酯等酯類物質主要與細菌屬存在關聯，如Lactobacillus、Weissella和Leuconostoc等細菌屬，除此之外，酯類物質普遍與真菌屬Pichia存在顯著的強正相關，同時Pichia與上述細菌屬均具有顯著的正相關性(圖6-b)。該結果表明，Pichia與Lactobacillus、Weissella和Leuconostoc為大曲中的產酯功能菌群。已有研究發現酯類主要合成途徑是酸和醇在酯化酶作用下的合成的[21]，兩者都需要微生物的參與，且發生在白酒發酵過程中。根據之前的報道，Lactobacillus、Weissella和Leuconostoc具有產酸能力，同時Pichia具有較強的產酯能力[22]，前者可通過代謝產酸為后者提供產酯前體物質。在2.2和2.4的研究中，發現上述產酯功能菌群是清香型大曲的優勢標記微生物，且清香型大曲的酯類含量顯著高于其他2種香型大曲(圖4-b)，進一步證明了該菌群具有產酯能力。由6-a圖可知，在大曲發酵過程中，Bacillus與2,3-丁二醇呈顯著正相關，這與之前Bacillus具有產2,3-丁二醇能力的報道一致[23]。在2.2和2.4的研究中也發現，濃香型大曲中Bacillus在菌群結構中占據絕對優勢，且2,3-丁二醇在濃香型白酒中含量顯著高于其他2種香型大曲。

a-微生物與重要風味物關聯分析；b-微生物間的關聯分析(紅線為正相關，黑線為負相關)圖6 微生物和風味成分的相關性網絡圖Fig.6 Correlation network between microbial genera and flavor compounds

3 結論與討論

本研究基于宏基因組學技術與代謝組學技術探究3種不同香型大曲間微生物與揮發性代謝物質間的組成差異，并通過關聯性分析解析造成3種大曲特征風味差異的內在原因。從微生物層面來看，3種大曲的微生物群落結構具有顯著差異。3種大曲的發酵溫度以清香、濃香到醬香呈遞增趨勢，因而大曲中的優勢菌屬隨著該趨勢慢慢演替至由耐高溫菌屬組成的優勢菌群，清香型大曲的優勢菌屬主要為Lactobacillus、Leuconostoc、Weissella、Streptomyces和Staphylococcus以及Pichia等產酸產酯菌屬，醬香型大曲的優勢菌屬主要為Saccharopolyspora和Bacillus等耐高溫菌屬[24]，而濃香型大曲菌群結構則介于2種大曲之間，兼具清香與醬香2種大曲優勢菌群的特色，既有耐高溫的優勢菌屬Bacillus，又存在Pichia等優勢產酯菌屬[22]。該結論同樣可以從圖1 觀察到，濃香大曲微生物PCoA1軸上，介于清香與醬香大曲之間。從宏基因組功能分析可知，3種香型大曲微生物在發酵過程中對淀粉及蛋白質等原料利用與轉化的代謝活動最為強烈，而其相關功能基因的比例存在顯著的差異，其中清香型大曲微生物在淀粉代謝、三羧酸循環、丙酮酸代謝和糖酵解等碳水化合物代謝活動的強烈程度均高于醬香型大曲與濃香型大曲，而醬香型大曲在總體氨基酸代謝的強烈程度則顯著高于其他2種大曲。從代謝物質層面來看，Pichia與Lactobacillus、Weissella和Leuconostoc作為清香型大曲標記微生物，是其產酯互作菌群。濃香型大曲中富含Bacillus，可代謝生成2,3-丁二醇和吡嗪，使其在濃香型白酒中含量顯著高于其他2種香型大曲。

本研究探究了3種香型大曲的標記微生物與典型風味物質，并通過關聯性分析揭示了其內在聯系，這對于尋找大曲中關鍵的產香微生物來強化不同香型白酒主體風味以及為后續的白酒釀造提供高質量大曲提供了理論基礎。后期工作可以基于該分析方法確定功能微生物，并對其進行篩選培養以及功能驗證，開發出功能型強化大曲，并將其應用于不同類型的白酒釀造中，在保證不同香型白酒特征風味的同時提高白酒整體品質。