一種基于劈裂適配體和雙信號的黃曲霉毒素M1電化學傳感器

杜聰聰，郭婷，周鴻媛，劉曉竹，張宇昊，3，4，馬良,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶微奧云生物技術有限公司，重慶，400039) 3(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，重慶，400715)4(發光分析和分子傳感教育部重點實驗室，重慶，400715)

黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM1)是哺乳類動物攝入被黃曲霉毒素 B1(aflatoxin B1，AFB1)污染的糧食或飼料后在動物體內產生的代謝產物，具有劇毒性和強致癌性[1]，被認定為I類致癌物[2]，是乳及乳制品中重點監控的真菌毒素，在乳及乳制品中的污染情況時有發生。MIN等[3]對我國十個省份的原料奶進行抽樣調查，發現江蘇地區部分原料奶中AFM1的污染濃度接近國家限量標準，對嬰幼兒有較大危害。郭耀東等[4]調查發現陜西地區2～4歲的兒童對AFM1有很高的攝入量。而在南亞及非洲地區AFM1在牛奶中有較高的污染量，常高于0.5 μg/L[5]。國內外對乳及乳制品中AFM1的限量制定了嚴格的標準。歐盟規定鮮奶、高溫消毒奶及奶制品中 AFM1的含量不能超過0.05 μg/kg，嬰幼兒配方乳品中 AFM1限量標準為 0.025 μg/kg[1]，我國規定牛奶和嬰幼兒奶粉中 AFM1的最大限量標準為0.5 μg/kg[6]。因此，高靈敏度、高準確性的AFM1檢測技術的研究與完善對保障乳品安全具有重要意義。

目前AFM1快速檢測方法主要有免疫親和層析法 (immunoaffinity chromatography，IAC)[7-8]、酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunesorbent assay，ELISA)[9]等，這些方法操作簡單、快速，但是抗體的制備成本高，而且穩定性較差[3]。相比于抗體，適配體制備成本低，周期短，且具有很好的靈敏度，對目標物也有良好的特異性，在食品安全檢測、環境監測等領域得到迅速發展。近年來，越來越多的科研工作者關注基于適配體構建的傳感器[10-13]。BEN-AISSA等[14]以二茂鐵(ferrocence,Fc)為信標物質，當AFM1的適配體識別測定AFM1時會引起適配體構象的改變，從而導致Fc探針電信號發生變化，以阻抗值為測定指標可靈敏檢測牛奶樣品中的AFM1。JALALIAN等[15]以亞甲基藍為電流信號物質，AFM1可使AFM1適配體的發夾結構解體，此時AFM1適配體互補鏈修飾的金納米顆粒因兩段適配體的互補配對接近電極表面，使得亞甲基藍的電流信號發生變化，實現對AFM1的檢測。KULIKOVA等[16]在玻碳電極上沉積聚苯胺，固定AFM1適配體之后，存在AFM1時引起適配體構象的變化從而使聚苯胺活性發生變化，并通過電信號表現出來。然而，已有研究表明，適配體的構象不穩定，很可能折疊成一些非特異性的二級結構，這將極大地阻礙適配體與靶標物的特異性識別，從而產生假陽性或非特異性信號[17]。

現有研究發現，完整的適配體劈裂成2個或2個以上片段以后，仍然可以在靶標物的作用下形成特定構象實現對靶標物的識別[18-23]，能夠有效解決適配體動態柔性結構造成的假陽性問題。因此，本研究以AFM1為目標物，采用劈裂適配體的方式解決假陽性問題，同時利用雙信號提高傳感器的靈敏度，構建基于劈裂適配體的雙信號電化學傳感器，實現牛奶中AFM1準確高靈敏度檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀，上海麥克林生化科技有限公司；適配體序列(S1:5′-SH C6-ACTGCTAGAGA-3′;CS1:5′-Fc-TCTCTAACAGT-3′;S2:5′-MB-TTTTCCACAT-3′)、PBS緩沖液(pH=7.4)，上海生工生物工程有限公司；磷酸三氯乙酯(trichloroethyl phosphate, TCEP)，上海阿拉丁有限公司;6-巰基乙醇(6-mercaptoethanol, MCH)，上海阿達瑪斯試劑有限公司;純牛奶(250 mL)、脫脂牛奶(1 L)，購于重慶本地超市。所用試劑均為分析純，試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

電化學工作站CHI600E、三電極系統(參比電極：CHI111銀/氯化銀，對電極：CHI115鉑絲電極，工作電極：CHI101金電極)，上海辰華儀器有限公司；氮吹儀，常州朗越儀器制造有限公司；離心機，賽默飛世爾科技公司；超微量分光光度計，德國凱傲集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 金電極的預處理

先后用直徑為0.3、0.05 μm氧化鋁顆粒的水漿打磨金電極至表面光滑，然后依次用乙醇和水進行超聲清洗。然后將電極浸入食人魚溶液V(H2SO4)∶V(H2O2)=3∶1中浸泡10 min，用水沖洗，氮吹干燥。最后在0.5 mol/L H2SO4中，以0.1 V/s的掃描速度，掃描電位為-0.2～1.6 V，進行掃描，循環40次，對金電極進行電化學拋光。將清洗好的金電極用水洗凈，氮氣吹干，待用。

1.3.2 基于劈裂適配體的電化學傳感器的構建

10 μL S1 (10 μmol/L)溶液在10 μL TCEP(1 mmol/L)溶液中孵育1 h，用PBS(pH=7.4)稀釋至200 μL，得到終濃度為0.5 μmol/L的S1溶液。將上述溶液置于2.5 mL的離心管中，然后將金電極浸入該溶液16 h，使得S1通過Au-S鍵固定在電極表面。使用上述電極前用氮氣吹干，將電極浸沒在1 mmol/L MCH溶液中。然后用PBS(pH=7.4)洗滌，氮氣吹干后，將電極浸沒在0.5 μmol/L的CS1溶液中，進行1 h雜交反應。傳感器平臺建立完成。取10 μL適配體S2(10 μmol/L)溶液，用PBS(pH=7.4)稀釋至200 μL，向適配體溶液加入一定濃度的AFM1，然后將建立的傳感器浸入上述溶液1.5 h。將每一步修飾過的電極放在含有 5.0 mmol/L 鐵氰化鉀{[Fe(CN)6]3-/4-}、0.1 mol/L KCl 的溶液中，采用循環伏安法(cyclic voltammetry, CV)和電化學阻抗法(elecctrochemical impedance spectroscopy, EIS)掃描表征。最后使用方波伏安法(square wave voltammetry, SWV)記錄Fc與亞甲基藍(methylene blue, MB)的電信號變化，在PBS(pH=7.4)中進行檢測，掃描速率為0.1 V/s，掃描電位為-0.6～0.8 V。

1.3.3 實際樣品的檢測

將不同濃度的AFM1標準品添加到空白樣品，將牛奶樣品用PBS(pH=7.4)稀釋，斡旋混勻后，高速離心并收集上清液，通過建立的 AFM1 電化學適配體傳感器進行檢測。

1.3.4 數據統計與分析

相關數據，使用Microsoft Office Excel 2019進行統計，并計算平均值和標準偏差，使用SPSS 22.0對數據進行方差分析(ANOVA)，使用Duncan′s 多重比較進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。使用Origin 2021進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 傳感器的檢測原理

本研究以AFM1為目標物，構建基于劈裂適配體的雙信號電化學傳感器，其檢測原理如圖1所示。將AFM1適配體劈裂成兩段(S1和S2)，S1修飾巰基，S2修飾MB作為傳感信號，S1的互補鏈CS1修飾Fc作為另一傳感信號。試驗中首先通過Au-S鍵將S1固定在電極表面。為了避免其他物質的非特異性吸附，用MCH溶液封閉電極表面多余的電位。體系中不存在AFM1時，S1與CS1形成雙鏈結構，只產生Fc的信號值(曲線a)。當體系中加入AFM1后，S1與CS1形成的雙鏈解開，CS1被釋放，S1與S2共同作用識別AFM1，此時Fc信號減弱，MB信號增強(曲線b)。

2.1.1 AFM1雙信號電化學適配體傳感器的構建

以 5.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(含 0.1 mol/L KCl)為電解液，采用CV及EIS監測AFM1雙信號電化學傳感器的構建(圖2)。從圖2-A中可以看出，與裸金電極(曲線a)相比，當S1固定在電極表面后，S1阻礙了電子在電極表面的傳遞，氧化還原電流峰值降低(曲線b)；傳感器的表面孵育MCH溶液后，金電極表面多余的電位被封閉，阻礙電子的傳遞，氧化還原電流峰值繼續降低(曲線c)；在體系中加入CS1后， CS1與S1結合，固定在電極表面之后，氧化還原電流峰值繼續降低(曲線d)。最后加入S2與AFM1，CS1被釋放，S1與S2形成一定構象識別AFM1，AFM1覆蓋在電極表面，電極表面的電子傳遞進一步被阻礙，氧化還原電流的峰值進一步降低(曲線e)。由CV表征結果可知，電化學傳感器成功制備，并且可以有效識別AFM1。

圖1 傳感器的傳感機理Fig.1 Illustration of sensor

EIS表征(圖2-B)進一步驗證雙信號電化學傳感器的成功構建。裸金電極(曲線a)的奈奎斯特曲線高頻區半圓的直徑較小，表明在裸電極表面電子轉移的速度很快；修飾S1后，由于電子傳遞被S1阻礙，直徑增加(曲線b)；加入MCH后，直徑進一步增加(曲線c)；之后加入CS1，CS1與S1結合形成雙鏈，阻礙電子傳遞，直徑增加(曲線d)。最后加入S2與AFM1，AFM1被識別覆蓋在電極表面，進一步阻礙電子傳遞，直徑進一步增加(曲線e)。這個結果與CV結果相一致，都證明了雙信號電化學傳感器已成功制備。

a-裸金電極；b-裸金電極/S1；c-裸金電極/S1/MCH； d-裸金電極/S1/MCH/CS1；e-裸金電極/S1/MCH/CS1/S2+AFM1 A-CV表征；B-EIS表征圖2 電化學適配體傳感器構建過程的CV和EIS表征Fig.2 Cyclic voltammetric characterization and electrochemical impedance spectroscopy of constructing electrochemical aptamer sensor

2.2 構建傳感器的條件優化

為了獲得性能優異的電化學傳感器，本研究以Fc與MB電流信號的比值(IMB/IFc)為評價指標研究適配體片段S1濃度和孵育時間對傳感器的影響。固定在金電極表面的S1濃度會嚴重影響傳感器的性能，較低的濃度可能導致傳感器對目標的檢測靈敏度不高，而高濃度S1會引起空間位阻和靜電斥力，同樣會導致靈敏度降低。固定孵育時間為1.5 h，探究不同S1濃度對傳感器檢測性能的影響。由圖3-A可知，S1的濃度在0.5 μmol/L時，IMB/IFc達到最大值，表明此濃度下的檢測效果最好。對數據進行統計發現，0.1、0.3、0.5 μmol/L存在顯著差異，濃度>0.5 μmol/L之后并不存在顯著性差異。因此，后續試驗選擇0.5 μmol/L。另外，傳感體系與目標物的孵育時間也是一個重要的影響因素。若孵育時間較短，劈裂適配體不能完全識別AFM1，影響檢測靈敏度。因此固定S1的濃度為0.5 μmol/L，探究不同孵育時間對傳感器檢測性能的影響。由圖3-B可知，S1的濃度為0.5 μmol/L時，隨著孵育時間的增加，IMB/IFc逐漸增大，孵育1.5 h后，IMB/IFc達到最大值。對圖中組數據進行統計分析發現，0.5、1、1.5 h存在顯著差異，1.5 h之后的結果不存在顯著性差異。因此，選擇1.5 h孵育時間進行后續實驗。

2.3 傳感器性能

2.3.1 線性范圍和檢測限

在上述最優實驗條件下，研究雙信號電化學傳感器的傳感性能。由圖4-A可以看出，隨著AFM1質量濃度的增大，MB信號逐漸增加，而Fc信號逐漸降低。這是因為S1與CS1形成的雙鏈解開，CS1釋放在溶液中，而S1與S2共同識別AFM1，S2被固定在電極表面，游離的S2減少。圖4-B表明，AFM1質量濃度為0.050～0.800 μg/L時，IMB/IFc值與AFM1質量濃度呈線性關系，符合線性方程IMB/IFc=7.734×C-0.064，C為AFM1濃度，決定系數R2=0.994，其檢測限為0.015 μg/L。圖4-C顯示了Fc或MB信號的變化圖，可以看到以MB或Fc單信號進行檢測，只有在AFM1質量濃度為0.050～0.200 μg/L時，IMB值才與AFM1的濃度才有較好的線性關系。IFc值也是如此。由此可以看出采用雙信號策略對AFM1檢測得到的線性范圍好于單信號策略。

A-S1孵育濃度；B-作用時間圖3 不同修飾條件下的IMB/IFc值的Fig.3 Values of IMB/IFcunder different modification conditions

A-AFM1濃度與SWV電流峰值的關系(AFM1質量濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μg/L)；B-不同AFM1濃度下 IFc/IMB的變化；C-不同AFM1濃度下MB與Fc電流峰值的變化圖4 AFM1濃度對電流信號的影響Fig.4 Influence of AFM1 concentration on current signal

2.3.2 選擇性

為了研究傳感器的選擇性，本研究以AFM1、AFM2、AFB1、AFG1、AFG2以及以上幾種毒素的混合液(AFM1、AFM2、AFB1、AFG1、AFG2)為對象考察該傳感器的選擇性。結果如圖5 所示，當加入0.2 μg/L AFM1時，IMB/IFc顯著增加。加入同等濃度的對照毒素時IMB/IFc遠遠低于AFM1存在時的比值。結果表明本研究所構建的傳感器對 AFM1有較好的選擇性。

圖5 不同毒素的電化學響應情況對比Fig.5 Comparison of electrochemical response values of different toxins

2.3.3 實際樣品檢測

選取純牛奶和脫脂牛奶為實際樣品進行加標回收研究，并與單信號電化學傳感器的檢測結果進行對比。在兩種樣品中分別加入3種不同濃度的 AFM1，經過樣品處理后，使用單信號電化學傳感器的加標回收率在76.28%～121.78%，而該雙信號電化序傳感器檢測的加標回收率在87.18%～105.32%，相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)均在10%以下，檢測效果優于單信號電化學傳感器，結果如表1 所示。這說明該雙信號電化學傳感器可用于真實復雜樣品中AFM1的測定。

表1 樣品加標回收試驗Table 1 Recovery test of AFM1 added to different samples

3 結果與討論

適配體結構的動態柔性特點限制了適配體在傳感技術中的應用，針對這個問題，本研究將完整的一段AFM1適配體劈裂成較短的兩段，分別修飾兩種不同的信號物質，通過兩種信號物質產生的信號反應AFM1的濃度，成功建立檢測AFM1的單信號和雙信號電化學傳感器，而且發現雙信號電化學傳感器的檢測性能明顯優于單信號電化學傳感器。在最優條件下，雙信號電化學傳感器的線性范圍為0.050～0.800 μg/L，檢測限為0.015 μg/L。且在實際樣品檢測中同樣表現出較好的效果，說明本檢測方法在食品安全檢測中具有較強的實用性，同時，為解決適配體的穩定性提供了一種方法。