發酵牛肉香腸肽的抗氧化穩定性研究

羅小嬋，張永東，孔祥穎，張偉，臧容宇，余群力*，韓玲

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(張掖市畜牧獸醫推廣站，甘肅 張掖，734000)3(青海省海北藏族 自治州畜牧獸醫科學研究所，青海 海北，812200)4(甘肅康美現代農牧產業集團有限公司，甘肅 臨夏，731500)

近年來，隨著人們食品安全意識的提高，抗氧化肽因安全性高、易吸收、活性強等優點引起了研究者的廣泛關注[1-2]。目前，已有部分抗氧化肽作為功能性食品和藥品實現了工業化生產[3-4]。抗氧化肽由蛋白質降解產生，在加工和貯藏過程中會發生水解、氧化、脫酰胺、環化等反應，導致肽鏈結構發生改變，進而影響其生物活性[5]?？寡趸牡姆€定性與溶液的酸堿性、溫度和鹽離子濃度等密切相關[6-7]，因此，對其在不同環境下穩定性的研究極其重要。

發酵肉制品是指在自然或人工控制的環境中，利用微生物或酶的作用使原料肉發生一系列復雜變化，形成具有良好的貯藏性和獨特風味、色澤與質地的肉制品，其在生產過程中蛋白質會發生強烈水解而產生具有生物活性的肽類物質[8]。郭世良等[9]酶解得到發酵酸肉肽，并發現強酸強堿、高溫、高糖、高NaCl及銅、鋅離子不利于其抗氧化活性的保持。ZHU等[10]用鹽酸浸提得到金華火腿抗氧化肽，發現其在酸性和中性條件下抗氧化活性較好，模擬胃腸消化會降低其活性。欒曉旭等[5]用磷酸浸提法從豬肉發酵香腸中提取到多肽，并發現在高溫和酸堿性環境中多肽活性喪失較快，糖類和NaCl會提高其自由基清除活性。可見，發酵肉制品中多肽抗氧化穩定性的研究主要集中在發酵酸肉、腌制火腿和豬肉香腸上，而以牛肉為原料制作的發酵香腸研究較少；同時，香腸制作方式不同，多肽提取方法不同，其抗氧化穩定性也可能產生差異。因此，以牛肉為試材制備發酵香腸，并探究其多肽在不同環境的穩定性顯得尤為重要。

本試驗采用鹽酸浸提法從發酵牛肉香腸中得到具有強抗氧化活性的多肽，研究熱處理、pH值、金屬離子、常溫貯存時間及模擬胃腸消化對其抗氧化活性的影響，為發酵牛肉香腸肽作為功能性食品和抗氧化劑的開發、生產和應用提供一定的理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛后腿肉，采自甘肅康美現代農牧產業集團有限公司；豬背膘、腸衣、食鹽等，購于江蘇雨潤肉食品有限公司；發酵劑(包括乳酸片球菌與戊糖片球菌)，科漢森食品添加劑有限公司；DPPH、亞硝酸鈉、抗壞血酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶，日本Solarbio公司；濃硫酸、濃鹽酸、三氯乙酸、水楊酸等(分析純)，乙腈、甲醇、正己烷等(色譜純)，蘭州新區鑫鑫尚信試劑經銷部。

1.2 儀器與設備

H2050R全自動高速冷凍離心機，北京海天友誠科技有限公司；RE-1001型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SPectramax M2型酶標儀，美國美谷分子儀器有限公司；FR-500型組織勻漿機，寧波新芝科器研究所；UV-8000T型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Rigol L3000高效液相色譜儀，德國SYKAM公司；ES2030冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵牛肉香腸的制備

工藝流程如下：

原料肉預處理→瘦肉絞碎、肥肉切丁→添加輔料、攪拌腌制→灌腸→發酵→干燥成熟→真空包裝→成品

操作要點：牛后腿肉要求新鮮，無筋膜、淤血及其他雜質，與豬背部脂肪一起漂洗干凈，將瘦肉攪碎，肥肉切丁，按m(肥)∶m(瘦)=2∶8混合，以混合后的肉質量為基礎，其他配料按鹽2.5%、抗壞血酸0.05%、亞硝酸鈉0.005%、蔗糖1%、葡萄糖1%、水10%和發酵劑0.025%添加(均為質量分數)不斷攪拌直至調料均勻，顏色均一，肉餡之間有黏連性，然后在4 ℃腌制12 h。將腌制后的肉餡灌入腸衣，灌裝過程中應注意排氣，防止腸體爆裂，灌裝后的腸體應飽滿緊繃，無肉眼可見氣泡。腸體清洗干凈后在24 ℃和92%相對濕度下發酵3 d，然后在14 ℃ 和77%相對濕度條件發酵并干燥32 d。取樣時，應去除腸衣，避免裸露產品表皮黏上白霉。

1.3.2 多肽的提取[10]

準確稱取20 g樣品，加入120 mL 0.06 mol/L HCl，勻漿(10 000 r/min，20 s×3)，靜置(4 ℃，2 h)，離心(10 000 r/min，4 ℃，20 min)。上清液經紗布過濾后加入4倍體積30%乙醇，靜置過夜(12 h)，相同條件下再次離心，上清液經旋轉蒸發、冷凍干燥得到多肽粉末。

1.3.3 體外抗氧化能力的測定

按照ZHU等[10]的方法測定DPPH自由基清除能力；參考馮美琴等[11]的方法測定羥自由基清除能力和鐵還原抗氧化能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)；參照YANG等[12]的方法測定清除超氧陰離子自由基的能力。

1.3.4 乳化活性與乳化穩定性的測定

參照GUO等[13]的方法測定乳化活性(emulsifying activity index，EAI)與乳化穩定性(emulsifying stability index，ESI)。以9∶1的體積比將多肽溶液與大豆油混合，乳化1 min后立即在距燒杯底5 mm處吸取30 μL乳化液，均勻分散在3 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液中，測定500 nm處吸光度值，同時以0.1% SDS溶液作為空白。計算如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：A0、A10,靜置0、10 min的吸光度；D,稀釋倍數；c,肽溶液的質量濃度，g/mL；φ,油相體積分數；10 000,校正系數。

1.3.5 起泡特性與泡沫穩定性

參考張京濤等[14]的方法，多肽起泡特性的計算如公式(3)和公式(4)所示：

(3)

(4)

式中：V0、V30分別表示勻漿液靜置0、30 min的泡沫體積。

1.3.6 游離氨基酸組成的測定

將100 μL樣品、氨基酸標準品溶液(17種，2.5 μmol/mL)、三乙胺乙腈溶液(pH>7.0)混合，加入10 μL 正亮氨酸內標溶液和50 μL異硫氰酸苯酯乙腈溶液，靜置1 h(25 ℃)，再加入200 μL正己烷，靜置10 min，下層溶液用0.45 μm濾膜過濾后上樣分析。高效液相色譜采用Kromasil C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；進樣量為10 μL；柱溫為40 ℃；流速為1 mL/min；無水乙酸鈉-乙腈水溶液(pH 6.5)作為流動相A；80%乙腈水溶液作為流動相B。

1.3.7 發酵牛肉香腸肽體外抗氧化能力的穩定性研究

1.3.7.1 熱處理對多肽抗氧化活性的影響

將多肽在室溫、40、60、80、100 ℃溫度下分別處理20 min 以及在100 ℃條件下分別處理0、10、20、30、40 min，冷卻至室溫測定DPPH自由基清除率、FRAP。

1.3.7.2 pH對多肽抗氧化活性的影響

用HCl和NaOH(1 mol/L)調整多肽溶液pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室溫振蕩反應2 h，測定DPPH自由基清除率、FRAP。

1.3.7.3 金屬離子對多肽抗氧化活性的影響

配制質量濃度為2 g/L的肽液，分別添加0、50、100、150、200、250 mg/L的NaCl和KCl，室溫振蕩反應2 h，測定樣品的抗氧化能力。

1.3.7.4 貯存時間對多肽抗氧化活性的影響

將多肽提取液在常溫下分別存放0、1、2、3、4 d，然后按照上述方法測其活性，研究貯存時間對其抗氧化活性的影響。

1.3.7.5 模擬胃腸消化對多肽抗氧化活性的影響

參照ZHU等[10]的方法并稍作修改。將多肽液pH值用HCl(1 mol/L)調至2.0，添加胃蛋白酶(3 000 U/mg)，保持溫度37 ℃，持續酶解2 h，酶解液置于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫后離心(4 ℃、6 000 r/min，10 min)。將上清液分為2份，1份用于測定多肽液經模擬胃消化后抗氧化活性的變化，另1份用NaOH(1 mol/L)調pH至7.0，添加胰蛋白酶(250 U/mg)，保持溫度37 ℃，持續酶解2 h后滅酶，冷卻，離心，收集上清液，-20 ℃貯存備用。

1.4 數據處理與統計分析

每個處理做3次重復試驗，數據采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析，結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，采用Origin 9.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 熱處理對發酵香腸肽抗氧化活性的影響

熱處理是食品加工中常用的手段，在較高溫度下多肽能否保持高活性，是評價其是否具有商業潛力的重要因素[6]。由圖1-a可知，常溫時DPPH自由基清除活性為69.8%，100 ℃時清除活性為72.2%，升高了2.4%。這可能是因為高溫處理雖然改變了多肽的空間構象，但其肽鏈并沒有斷裂，只是部分二級結構展開，暴露出一些活性位點，使DPPH自由基清除活性增強[15]。FRAP值在40 ℃時顯著下降(P<0.05)，之后溫度對其無顯著影響(P>0.05)。圖1-b是同一溫度不同處理時間對樣品抗氧化能力的影響。DPPH自由基清除活性和FRAP值在加熱10 min時顯著下降(P<0.05)，20 min后加熱時間對DPPH自由基清除活性無顯著影響(P>0.05)，FRAP在30 min時最高。肖嵐等[16]發現牦牛血低聚肽的羥自由基清除活性在100 ℃處理5 h仍有84.32%，與本實驗結果一致。因此，發酵牛肉香腸肽具有較好的熱穩定性，在其提取和加工處理中，熱處理并不會影響其活性。

2.2 pH對發酵香腸肽抗氧化活性的影響

pH可通過影響肽的電離勢和電子轉移能力來影響肽的抗氧化活性[5]。由圖2可知，在pH為3.0時，發酵香腸肽的DPPH自由基清除活性和FRAP值最高，分別為91.64%和0.306，之后隨著pH上升顯著下降(P<0.05)。在中性環境(pH 7.0)時，DPPH自由基清除活性仍能保持70%以上，當其處于堿性環境(pH 11.0)，清除活性較pH 3.0下降了46.56%。因此，發酵香腸中多肽的DPPH自由基清除活性對堿性環境更敏感，肽類物質在堿性環境下會發生脫酰胺或外消旋反應，從而導致多肽活性下降[5]。綜上所述，發酵牛肉香腸肽的耐堿性較弱，為了保持較好的抗氧化活性，應避免其處于強堿性環境中。

圖2 pH對發酵香腸肽抗氧化活性的影響Fig.2 Changes in antioxidant activities of peptides extracted from fermented sausages in different pH

2.3 金屬離子對發酵香腸肽抗氧化活性的影響

食品體系中金屬離子廣泛存在，攝入適量金屬離子對機體的生理平衡有重要意義[6]。由圖3-a可以看出，隨著Na+濃度的提高，多肽的DPPH自由基清除活性顯著上升，當Na+質量濃度為150 mg/L時，DPPH自由基清除活性達到最大值84.77%；相反地，FRAP值隨Na+濃度升高顯著降低(P<0.05)；當Na+質量濃度為200 mg/L時，DPPH自由基清除活性和FRAP值均能達到較高水平?？赡苁且驗镹aCl溶液電離產生的Cl-和Na+能中和香腸多肽表面的電荷，使水化膜遭到破環，暴露出的供氫或供質子體與自由基結合，抗氧化活性隨之增強[9]。

圖3-b反映的是K+濃度對多肽抗氧化能力的影響。當K+的質量濃度為50 mg/L時，DPPH自由基清除活性達到最大值86.87%，但此時FRAP下降至最低值；當K+的質量濃度為150 mg/L時，DPPH自由基清除活性和FRAP值均維持在較高水平。PEREIRA等[17]研究指出肽與含有NaCl的食品基質之間的相互作用有利于肽生物活性的維持；孫浩等[7]研究發現K+會提高苦蕎抗氧化肽AFYRW的·OH清除率，這與本實驗的結果相一致。綜上，適量的Na+、K+會增強發酵牛肉香腸肽的抗氧化活性，Na+質量濃度為200 mg/L，K+質量濃度為150 mg/L時抗氧化活性最好。

a-Na+濃度對抗氧化活性的影響；b-K+濃度對抗氧化活性的影響圖3 Na+、K+濃度對發酵香腸肽抗氧化活性的影響Fig.3 Changes in antioxidant activities of peptides extracted from fermented sausages in different Na+ and K+ contents

2.4 貯存時間對發酵香腸肽抗氧化活性的影響

發酵香腸肽在提取分離過程中易長時間暴露在空氣中，對活性產生影響。圖4為其室溫下處理0、1、2、3、4 d的結果。當處理1 d時，與對照相比DPPH自由基清除活性上升了約10%，當處理2 d時，活性下降顯著(P<0.05)，之后隨處理時間延長無顯著變化(P>0.05)，FRAP整體變化差異不顯著(P>0.05)。可能是因為肽段暴露在空氣中發生了氧化反應或吸濕后發生了水解反應，導致多肽結構和氨基酸組成發生改變，使活性降低[18]。因此，對發酵牛肉香腸肽進行提取和分離時，應注意控制溫度和時間，避免其長時間暴露在空氣中。

圖4 貯存時間對發酵香腸肽抗氧化活性的影響Fig.4 Changes in antioxidant activities of peptides extracted from fermented sausages in different storage time

2.5 模擬胃腸消化對發酵香腸肽活性的影響

2.5.1 模擬胃腸消化對發酵香腸肽乳化活性與乳化穩定性的影響

由圖5可知，EAI與ESI的變化相似，經過2 h模擬胃消化后，EAI和ESI顯著升高62%和16%(P<0.05)。這可能是因為肽段在胃蛋白酶的作用下持續水解，分子質量變小，一些疏水性基團暴露出來，增強了與油的結合能力，從而提高多肽乳化性[19]。在添加胰蛋白酶后，EAI和ESI顯著下降(P<0.05)，但EAI仍保持在80%以上，此時與消化前相比EAI升高了43%，ESI降低了18%?？赡苁且驗殡S著胰蛋白酶的進一步作用，小分子肽水解過度，疏水基團暴露過多，打破了形成表面活性層的平衡，降低了乳化性能[13]?？偟膩碚f，模擬胃腸消化對香腸肽的乳化活性有一定提高，但不利于乳化穩定性。

2.5.2 模擬胃腸消化對發酵香腸肽起泡特性的影響

蛋白質起泡性與蛋白質的分子大小及表面極性基團有關，分子大小越合適，極性基團越多，起泡性就越高[20]。香腸肽仍以蛋白質為主體物質，可見其具有一定的乳化性能。由圖6可知，多肽起泡性和泡沫穩定性經2 h模擬胃消化后顯著升高(P<0.05)，經第二階段模擬腸道消化后又顯著降低(P<0.05)，較消化前起泡性和泡沫穩定性分別升高15%和11.7%。在一定酶解范圍內，分子質量越小溶解性越好，此時更多的肽分子參與液膜的形成，起泡性增強，但肽鏈太短會使泡沫表面黏彈性降低，液膜間作用變弱，最終導致起泡性隨分子質量減小反而下降[14]?？偟膩碚f，香腸多肽經模擬胃腸消化后具有較好的起泡特性。

圖5 模擬胃腸消化對發酵香腸肽乳化特性的影響Fig.5 Effects of simulated gastrointestinal digestion on emulsifying properties of peptides extracted from fermented sausages

圖6 模擬胃腸消化對發酵香腸肽起泡特性的影響Fig.6 Effects of simulated gastrointestinal digestion on foaming characteristics of peptides extracted from fermented sausages

2.5.3 模擬胃腸消化對發酵香腸肽抗氧化活性的影響

由圖7可知，經2 h模擬胃消化后，DPPH自由基清除活性增加至74.2%(P<0.05)，這可能是因為在模擬胃消化過程中暴露出更多的疏水性氨基酸側鏈[8]。再經過第二階段模擬腸消化后，DPPH自由基清除活性又顯著下降至57.23%(P<0.05)?？赡苁且驗榻浺鹊鞍酌高M一步酶解后，部分活性多肽裂解，疏水基團暴露過度，導致抗氧化活性降低[9]。清除超氧陰離子自由基的能力與DPPH自由基清除活性變化相似，經胃蛋白酶消化后，清除率從45.5%顯著升高到74.5%，再經胰蛋白酶消化后又顯著下降至64.1%(P<0.05)。羥自由基清除活性在2個消化階段均顯著升高(P<0.05)，這與張淼[21]發現玉米蛋白水解物經體外消化后羥自由基清除能力顯著增加的結果相似。模擬消化結束后，FRAP值從0.439顯著增加至0.518(P<0.05)，這可能與酶解液中顯著增多的中性和酸性氨基酸有關[22]。經過模擬胃腸消化，多肽的羥自由基、超氧陰離子自由基清除活性及FRAP值分別升高31.86%、18.6%和0.079(P<0.05)。綜上，發酵香腸中多肽含有抗氧化活性片段，且其被人體吸收后仍能發揮較大作用。

圖7 模擬胃腸消化對發酵香腸肽抗氧化活性的影響Fig.7 Effects of simulated gastrointestinal digestion on antioxidant activities of peptides extracted from fermented sausages

2.5.4 模擬胃腸消化對發酵香腸肽游離氨基酸的影響

模擬胃腸消化對多肽游離氨基酸含量的影響如表1所示?？傮w來看，經模擬消化后，總游離氨基酸含量從322.146 mg/L顯著增加到389.123 mg/L(P<0.05)，這可能是因為胃蛋白酶和胰蛋白酶破壞了多肽的二級結構，將其水解成更小分子的肽，同時生成大量游離氨基酸[23]。研究表明，氨基酸在抗氧化反應中起重要作用，其作為電子供體，能夠直接與自由基結合，形成有利于發揮抗氧化活性的構象[24]。經過2段酶解后，多肽液中Val、Pro、Ala、Leu、Tyr等疏水性氨基酸含量顯著增高(P<0.05)，Arg、Lys等具有金屬離子螯合能力的氨基酸也顯著增多(P<0.05)。

表1 模擬胃腸消化對發酵香腸肽游離氨基酸組成的影響 單位：mg/L

3 結論

本試驗探究了多種加工貯存條件及模擬胃腸消化對發酵牛肉香腸中多肽抗氧化穩定性的影響。結果表明，熱處理對發酵香腸多肽抗氧化活性無顯著影響；酸性和中性環境有利于其抗氧化活性的保持；Na+、K+可促進多肽的抗氧化活性；長時間室溫貯存不利于多肽抗氧化活性的保持；模擬胃腸消化后疏水性氨基酸增多，多肽抗氧化活性、乳化活性、起泡性和泡沫穩定性增強。發酵牛肉香腸肽具有較好的抗氧化穩定性，這為其合理開發及有效利用提供理論依據。