品種和后成熟度對非濃縮還原蘋果汁渾濁穩定性的影響

劉啟輝，俞之豪，李敏波，張婉珍，周林燕，胡小松,2，易俊潔*

1(昆明理工大學 農業與食品學院，云南 昆明，650500)2(中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京，100083)

近年來，隨著產品多元化發展和人們營養健康意識的增強，消費者對高品質食品的需求日益增長。非濃縮還原(not from concentrate，NFC)果汁，即鮮榨果汁，因其最大程度地保留了果汁原有的風味和口感，符合人們對健康、天然、安全食品的追求而受到廣泛關注[1-2]。中國是世界上蘋果種植規模最大、產量最高的國家[3]，而蘋果汁是重要的蘋果深加工產品之一，可以有效地解決蘋果采后過剩問題，并增加蘋果產品的附加值。雖然我國蘋果汁市場仍以濃縮汁為主，但NFC蘋果濁汁的市場占有率正在不斷增長。與蘋果濃縮汁相比，NFC蘋果汁不僅含有更多的果肉纖維和更飽滿的口感，多酚和果膠的含量也更加豐富[4]，但渾濁不穩定、易分層已嚴重制約了NFC蘋果汁產業的發展[5]。

影響蘋果濁汁渾濁穩定性的主要因素是果汁中分子間的相互作用和顆粒的聚合，其沉淀顆粒物主要包含多酚、蛋白質和果膠[6]，不溶性淀粉也是造成蘋果濁汁沉淀的主要原因之一[7]。雖然，目前已有不少研究關注NFC果汁的品質及其穩定性，但主要集中在對比不同加工方式和貯藏期[8-9]，對原料加工特性的研究較少。另外在實際生產中，用以榨汁的蘋果原料多來源于采摘后的庫存蘋果，冷藏過程中催熟氣體(如乙烯)的釋放會造成蘋果出現后熟，隨著貯藏時間延長，乙烯等氣體不斷累積，蘋果逐漸成熟直至衰老[10]。然而，原料后熟對NFC蘋果汁渾濁混定性的研究還未見報道。

因此，本研究以華碩、富士、嘎啦、金冠、澳洲青蘋等5個品種的蘋果作為研究對象，并模擬蘋果果實采摘后，4 ℃冷庫貯藏，測定不同后熟度的蘋果原料制作的NFC蘋果汁的理化特性(pH值、可溶性固形物和可滴定酸)、渾濁穩定性(濁度、ζ-電位和粒度)和沉淀敏感物質(不溶性淀粉、總酚、可溶性蛋白和果膠)的變化趨勢，進而分析影響NFC蘋果汁渾濁穩定性的重要因素，為改善NFC蘋果汁渾濁穩定性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果原料均產自云南昭通，由昭通超越農業有限公司提供，于2019年9月收獲，共采收了色澤、質構差異較大的5個商業品種作為研究對象，分別為華碩、富士、嘎啦、金冠和澳洲青蘋，采收果實均無機械損傷和病蟲害(圖1)。蘋果采摘后于4 ℃冷庫貯藏，根據貯藏時間分為3個后成熟階段，分別為剛采摘(Ⅰ)、冷藏30 d(Ⅱ)和冷藏60 d(Ⅲ)。

抗壞血酸(食品級)，麥克林生化科技有限公司；可溶性淀粉標準品、沒食子酸標準品、半乳糖醛酸標準品和考馬斯亮藍G250，上海阿拉丁生化科技有限公司；其余試劑均為分析純，上海源葉生物科技有限公司。

a-蘋果果實；b-蘋果果汁圖1 不同品種和后成熟度的蘋果果實和果汁Fig.1 Different cultivar and late ripening stages of apple fruits and juice

1.2 儀器與設備

JYZ-E3榨汁機，九陽股份有限公司；L-550離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；FE28型pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TD-45數顯糖度計，北京金科利達電子科技有限公司；UV-6100S型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Spectra Max M5多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司；907型自動電位滴定儀，瑞士萬通公司；Agilent 1200高效液相色譜儀、1260系列蒸發光散射檢測器，美國Agilent公司；Asahipak NH2P-50 4E色譜柱，日本Shodex公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蘋果汁的制備

為了降低壓榨過程中NFC蘋果汁的褐變程度，首先將蘋果去皮、去核、切塊，用螺旋榨汁機進行榨汁，并加入0.500 g/L食品級抗壞血酸[8]。蘋果汁經過膠體磨和高壓均質(20 MPa)后，混勻分裝至150 mL塑料瓶。部分樣品在處理后立即測定濁度、ζ-電位和粒度，其余樣品用液氮進行速凍，并于-18 ℃冷凍保存，需測定其他品質指標前，水浴解凍至室溫。

1.3.2 pH值、可溶性固形物、可滴定酸的測定

首先將果汁混勻，采用pH計測量每個樣品的pH值；采用數字折光儀測定可溶性固形物，結果以°Brix表示。所有測量在室溫下進行，均重復3次。

采用電位滴定法測定樣品的可滴定酸[9]，首先取10 g果汁稀釋至250 mL，通過自動電位滴定儀用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定至終點pH 8.1，每個樣品均進行3次平行實驗。記錄消耗NaOH標準溶液的體積，最終結果以蘋果酸計。可滴定酸的含量計算如公式(1)所示：

(1)

式中：V為滴定消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；C為氫氧化鈉溶液濃度，0.1 mol/L；W為果汁質量，g；K為蘋果酸折算系數，0.067。

1.3.3 濁度的測定

果汁的濁度采用紫外分光光度計法測定[9]。取10 mL蘋果汁在室溫4 200×g離心15 min，取上清液在660 nm下測定吸光值，每個樣品均進行3次平行實驗。濁度計算如公式(2)所示：

濁度=100-100×10-Abs

(2)

式中：Abs為樣品在660 nm下的吸光值。

1.3.4 ζ-電位的測定

ζ-電位的測定首先將5 mL蘋果汁在4 ℃下離心(4 200×g)15 min后，取上清液，在室溫條件下用動態光散射納米粒度分析儀測定ζ-電位[11]。控制溫度為10 ℃，選擇水為溶劑的參比體系。每個樣品均進行3次平行實驗。

1.3.5 粒度的測定

采用動態光散射法測定蘋果汁粒度大小和分布，首先將蘋果汁加入到以水為介質的燒杯中，樣品稀釋后用激光束照射，每個樣品進行3次平行實驗。

1.3.6 不溶性淀粉的測定

采用碘量法測定樣品中不溶性淀粉的含量[7]。首先取5 mL果汁，通過1 000×g離心20 min，收集沉淀，并將沉淀物懸浮于2 mol/L NaOH中溶解，并用0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH 4.6)稀釋。用碘量法測定沉積物中的不溶性淀粉。每個樣品進行3次測定。

1.3.7 單糖的測定

參照YI等[12]的方法測定蘋果汁中的單糖含量，并稍作修改。將10 mL果汁與500 μL試劑1{150 g/L K4[Fe(CN)6]}和500 μL試劑2(300 g/L ZnSO4)混勻，靜止30 min后，8 000×g離心20 min，上清液過0.45 μm過濾糖的分析使用高效液相色譜系統結合蒸發光散射檢測器，5 μL稀釋提取液通過Asahipak NH2P-50 4E色譜柱在30 ℃下等度洗脫(75%體積分數乙腈-水)，流速為1 mL/min。以葡萄糖標準溶液的保留時間進行鑒別。用標準溶液的校準曲線進行定量。每個樣品的提取和分析重復3次。

1.3.8 總酚的測定

總酚的提取和測定參照WANG等[13]的方法。首先，將2 mL蘋果汁中加入8 mL的80%(體積分數)的甲醇溶液，常溫超聲提取15 min，8 000×g離心15 min，取上清液，即為多酚粗提液。重復上述操作2次保證提取完全。采用福林酚法測定總酚含量。福林酚試劑用蒸餾水按1∶9(體積比)稀釋，取0.4 mL 多酚提取液樣品與2 mL稀釋的福林酚試劑混合，加入1.8 mL 75 g/L的Na2CO3溶液，常溫避光下反應2 h，用酶標儀測定765 nm處的吸光值，總酚含量以100 mL樣品含有相當于mg沒食子酸表示(mg沒食子酸/100 mL)。每個樣品進行3次平行實驗。

1.3.9 可溶性蛋白的測定

采用考馬斯亮藍法[14]測定果汁中的可溶性蛋白。取蘋果汁0.5 mL加入試管，然后在其中加入4.5 mL 的蛋白質反應液，用漩渦振蕩器快速混勻后，靜置2 min，再用紫外分光光度計測定595 nm下的吸光值。用0.50 mL的蒸餾水代替果汁作為空白，每個樣品進行3次平行測定。

1.3.10 果膠的測定

按照FRAEYE等[15]方法提取蘋果汁中的醇不溶性物質。將50 mL蘋果汁與320 mL 95%(體積分數)乙醇混合后，用打漿機攪拌3次，每次6 s，抽濾得到沉淀，將沉淀再次與160 mL 95%乙醇混合，重復上述操作，最后用丙酮沖洗得到白色、均一的粉末，于40 ℃烘箱中干燥至恒重。用分光光度計按照比色法測定果膠含量。在10 mg乙醇不溶物中加入5 mL濃硫酸-四硼酸鈉溶液(0.015 mol/L)后立刻放入冰水浴中，避免溫度上升過快。用混合器混合后，放在100 ℃水浴中加熱5 min，反應后立刻放入冰水浴中，直到達到室溫。加入0.1 mL間苯基苯酚溶液，混合后于520 nm處讀取吸光值。每個樣品進行3次平行實驗。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2010軟件對實驗數據進行處理，采用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行顯著性分析，采用Tukey檢驗分析顯著性水平(P<0.05)，采用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 NFC蘋果汁理化特性分析

pH值、可溶性固形物和可滴定酸是NFC果汁加工重要的品質控制理化指標。如表1所示，不同品種的蘋果濁汁pH值存在顯著差異，嘎啦蘋果汁的pH值最高(3.88～4.02)，其次是華碩(3.79～3.92)，澳洲青蘋的pH值最低(3.12～3.24)。隨著不斷后熟，蘋果汁pH值呈現上升趨勢。高麗萍等[16]在NFC草莓汁也發現相似的趨勢。

表1 不同品種和后熟度NFC蘋果汁pH值、可滴定酸和可溶性固形物Table 1 pH value, total soluble solids, and titratable acids of NFC apple juice during late ripening

可滴定酸是體現NFC果汁酸度的重要指標。品種對NFC蘋果汁可滴定酸含量的影響顯著，其可滴定酸含量由高到低依次為：澳洲青蘋(1.16%)> 華碩(0.97%)> 富士(0.73%)> 金冠(0.66%)> 嘎啦(0.64%)，與NFC蘋果汁pH值呈正相關。隨著貯藏期延長，蘋果汁可滴定酸含量均呈現下降趨勢，進一步驗證了NFC蘋果汁在后熟過程pH值上升的趨勢。這可能是因為果實成熟過程中有機酸轉變為碳水化合物或者被氧化，導致有機酸含量下降[16]。王志華等[17]在“塞外紅”蘋果中也發現相似的變化趨勢。

品種和后熟度對蘋果汁可溶性固形物影響顯著。富士的可溶性固形物含量最高(約12.23 °Brix)，其次是嘎啦(約11.17 °Brix)、華碩(約10.67 °Brix)和澳洲青蘋(約10.03 °Brix)，金冠蘋果濁汁的可溶性固形物含量最低(約9.27 °Brix)，對應甜味依次減弱。隨后熟度增加，澳洲青蘋的可溶性固形物含量增加，這可能是由于淀粉轉化成了可溶性糖[7]，而華碩、富士和金冠蘋果汁的可溶性固形物含量出現先升高后下降的趨勢這可能是因為蘋果貯藏中后期淀粉被轉化殆盡，果實開始衰老，可溶性固形物作為果實的呼吸底物不斷被消耗導致其逐漸下降[16]。嘎啦蘋果汁的可溶性固形物含量未發生顯著變化。

2.2 NFC蘋果汁濁度分析

濁度能直接反映出果汁體系的穩定性，其值越大，果汁體系越穩定[18]。由圖2可知，不同品種蘋果汁濁度差異顯著，采摘初期(Ⅰ)，華碩蘋果汁的濁度最低，僅為4.21，嘎啦蘋果汁的濁度最高(27.89)。隨著不斷后熟，NFC蘋果汁的濁度增加，這與趙光遠等[6]的研究結果一致。后熟階段Ⅱ時，金冠的濁度上升值至最大，約為45.05，其次是嘎啦(23.81)，而富士和澳洲青蘋的增長量較少，分別為3.14和5.33。華碩的濁度在前2個階段未發生顯著性變化。在第Ⅲ階段時，華碩、富士、金冠和澳洲青蘋NFC蘋果汁的濁度均增加，嘎啦蘋果汁的濁度減少，這可能是由于果膠含量的變化導致的[19]。

濁度變化與觀察到的蘋果汁渾濁穩定狀態一致(圖1-b)。后熟初期，蘋果濁汁均出現肉眼可見的分層沉淀，對應濁度值低。隨著成熟度增加，嘎啦和金冠的混濁穩定性在第Ⅱ階段得到顯著改善，濁度值分別增加至59.79和48.98。富士和澳洲青蘋則在第Ⅲ階段達到穩定狀態，濁度值分別為33.06和59.85。在Ⅲ階段，嘎啦蘋果汁底部再次出現肉眼可見的沉淀，與濁度先上升后下降的趨勢一致。華碩的混濁穩定性未隨成熟度增加得到改善，果汁始終呈現上層液體透明、下層是沉淀的分層狀態。

圖2 不同品種和后熟度NFC蘋果汁濁度Fig.2 Turbidity of NFC apple juice with different varieties and during late ripening 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 NFC蘋果汁粒度分析

蘋果濁汁中果肉顆粒以懸浮狀態分散于果汁體系，蛋白質(約40%)、酯類(30%)、原花青素(5%)、多糖(5%)、果膠(2%)等是構成果肉顆粒的主要組分[4]。蘋果濁汁的懸浮穩定性遵循斯托克斯沉速公式，顆粒大小直接影響顆粒的沉降速度：蘋果濁汁顆粒的粒徑與沉降速率成正比，粒徑越大，沉降速率越快[4]。

不同品種NFC蘋果汁的粒徑分布隨后熟度變化規律如圖3所示，蘋果濁汁的粒徑分布主要呈典型雙峰分布[5]。不同品種之間的粒度分布不同。采摘初期(Ⅰ)，華碩和富士蘋果汁的粒徑分布規律相似，小顆粒粒徑為8～10 μm，大顆粒粒徑在300 μm左右。嘎啦和金冠中大顆粒占比較大，粒徑分布主要在200 μm左右，澳洲青蘋汁中小顆粒占比大，粒徑分布集中于10 μm左右。粒徑分布范圍與YI等[12]測得的蘋果汁粒徑分布結果相似。隨著后熟度增加，華碩、富士和嘎啦3種果汁的大粒峰面積減小，蘋果汁的粒徑分布只呈現1個峰，分別位于20、30和60 μm左右，表明樣品中顆粒分布更加均勻。金冠蘋果濁汁則在0.6和1.2 μm處出現2個新峰，說明體系中小顆粒增加。總體來說，后熟度越高，蘋果濁汁的粒徑分布越均勻，粒度變小，使得蘋果汁渾濁穩定性提高。這可能是由于成熟過程中蘋果細胞壁結構不斷分解，使得果汁中的懸浮顆粒更分散、更細小造成的[13,20]。

2.4 NFC蘋果汁ζ-電位分析

蘋果汁是一個膠體體系，ζ-電位可以表征膠體顆粒之間相互作用，用于評估膠體系統的穩定性。當所有顆粒都具有較大的正或負ζ-電位時，它們將相互排斥，并且具有分散穩定性，反之，當顆粒的ζ-電位絕對值較低時，則沒有力阻止粒顆粒聚集在一起[21]。膠體系統穩定與不穩定的分界線通常在+30或-30 mV，一般認為，ζ-電位絕對值大于30 mV時系統是穩定的[21]。

a-華碩；b-富士；c-嘎啦；d-金冠；e-澳洲青蘋圖3 不同品種和后熟度蘋果汁的粒度分布Fig.3 Pareicle size distribution of NFC apple juice with different varieties and during late ripening

如圖4所示，蘋果汁中懸浮顆粒整體帶負電，且ζ-電位的絕對值均小于30 mV，說明蘋果濁汁是不穩定的膠體系統。不同品種NFC蘋果汁ζ-電位差異顯著，采摘初期(Ⅰ)，華碩的ζ-電位絕對值最大(-4.36)，其次是金冠(-4.06)、富士(-3.92)和嘎啦(-3.30)，澳洲青蘋的ζ-電位絕對值最小(-2.62)。在后熟階段Ⅲ，從大到小依次為：金冠(-4.84)>華碩(-4.53)>富士(-4.35)>嘎啦(-4.34)>澳洲青蘋(-3.53)。隨成熟度增加，NFC蘋果汁對應的ζ-電位絕對值均呈現上升趨勢，反映出蘋果濁汁的膠體系統越來越穩定。這與趙光遠等[6]的研究結果一致，隨著蘋果原料貯藏時間延長，果汁中帶負電荷的果膠含量增加，從而增加了濁汁體系的懸浮粒子的ζ-電位，提高了蘋果汁的渾濁穩定性。

圖4 不同品種和后成熟度蘋果汁ζ-電位Fig.4 ζ-potential of apple juice with different varieties and during late ripening

2.5 NFC蘋果汁沉淀敏感物質

影響蘋果濁汁渾濁穩定性的主要因素是果汁中分子間的相互作用和顆粒的聚合，其沉淀顆粒物主要包含多酚、蛋白質和果膠[6]，不溶性淀粉也是造成蘋果濁汁沉淀的主要因素之一[7]。

不同品種不溶性淀粉含量隨成熟度變化如圖5-a所示。后熟初期，蘋果濁汁不溶性淀粉含量差異顯著，其中澳洲青蘋淀粉含量最高，約5.20 mg/mL，其次是富士(4.26 mg/mL)、嘎啦(4.23 mg/mL)和金冠(3.58 mg/mL)，華碩的不溶性淀粉含量最低，約為2.31 mg/mL。澳洲青蘋早期淀粉含量高與SORRIVAS等[11]的研究結果一致，未成熟蘋果汁的淀粉含量高達8.00 mg/mL。隨成熟度增加，NFC蘋果汁中的不溶性淀粉呈現下降趨勢，與CARRN等[7]研究結果相似。后熟過程中淀粉含量降低，逐漸降解成可溶性單糖(葡萄糖)，可以提高蘋果濁汁甜味和渾濁穩定性[4]。圖5-b展示NFC蘋果汁葡萄糖含量隨后熟度變化規律。采摘期，富士、嘎啦、金冠和澳洲青蘋葡萄糖含量沒有顯著性差異，約為10 mg/mL，華碩蘋果汁葡萄糖含量略高，約12.90 mg/mL。隨著成熟度增加，蘋果的葡萄糖含量升高，與淀粉的降解緊密相關。

酚類和蛋白質的聚合被認為是造成蘋果汁沉淀的重要因素[22]。不同品種蘋果汁在3個后熟階段蛋白質含量如圖5-c所示。在采摘初期，5種蘋果汁的蛋白質含量均在25 μg/mL左右。隨著后熟度增加，除華碩外，富士、嘎啦、金冠和澳洲青蘋果汁蛋白質含量增加，至后熟階段Ⅲ，金冠蘋果汁的蛋白質含量最多，約為35.14 μg/mL，其次是澳洲青蘋(31.82 μg/mL)、富士(30.68 μg/mL)和嘎啦(30.60 μg/mL)。這可能因為蘋果果肉隨成熟度增加，結構變得松散，在榨汁機械力的作用下，細胞內容物更易滲出[23]。

圖5-d展示了不同品種蘋果濁汁總酚含量隨后熟度的變化。采摘初期，蘋果汁的酚類物質含量高且品種間差異顯著。華碩的總酚含量最高，約為291.63 mg沒食子酸/100mL，其次是澳洲青蘋(288.56 mg沒食子酸/100mL)和嘎啦(270.94 mg沒食子酸/100mL)，金冠和富士的總酚含量相對較低，分別為197.95和165.58 mg沒食子酸/100mL。隨后熟度增加，5種蘋果汁酚類物質含量減少，至后熟階段Ⅲ，含量低，約為1.59～6.96 mg沒食子酸/100mL。這與衛世乾[24]的研究結果一致，蘋果采摘后冷藏期間總酚含量呈現下降趨勢。酚類物質減少，導致酚類-蛋白質聚合物減少，進而對蘋果汁混濁穩定性起到促進作用。

蘋果果膠是蘋果濁汁云狀體系的重要組成部分。蘋果果膠對于維持濁汁穩定性具有積極作用，能夠包裹在濁汁體系內的顆粒外，為相互作用的顆粒提供保護涂層，進而增加體系穩定性[25]。如圖5-e所示，5種蘋果汁在采摘初期果膠含量較低，華碩、富士、嘎啦、金冠和澳洲青蘋的果膠含量分別為1.31、2.83、7.58、0.66和0.81 mg/mL。隨后熟度增加，華碩、富士、金冠和澳洲青蘋NFC蘋果汁的果膠含量呈上升趨勢，這與趙光遠等[6]的研究結果一致，剛采摘的蘋果中原果膠含量高，且不溶于水。而隨著貯藏時間的延長，蘋果逐漸成熟，蘋果內的原果膠酶將蘋果中的原果膠轉變成水溶性果膠，有利于增加體系的穩定性。嘎啦蘋果汁的果膠呈現先上升后下降的趨勢，這與NG等[18]研究結果變化趨勢一致。

a-不溶性淀粉；b-葡萄糖；c-總酚；d-可溶性蛋白；e-果膠圖5 不同品種和成熟度NFC蘋果汁中不溶性淀粉、葡萄糖、總酚、可溶性蛋白和果膠含量Fig.5 The concentration of insoluble starch, glucose, total phenols, soluble protein, and pectin in NFC apple juice with different varieties and during late ripening

3 結論

渾濁穩定性差是制約NFC蘋果汁產業發展的重要因素，而品種和后成熟度對其渾濁穩定態有著顯著的影響。對比不同品種發現，富士、嘎啦、金冠和澳洲青蘋NFC蘋果濁汁的渾濁穩定性隨后成熟度的增加呈現上升趨勢，而華碩蘋果濁汁渾濁穩定性差，后成熟對其影響不顯著，均出現顯著的分層沉淀，較不宜選為NFC蘋果濁汁的加工原料。品種和成熟度對NFC蘋果濁汁渾濁穩定性的影響與其沉淀敏感物質組成和含量不同緊密相關。不同品種和后熟度原料蘋果的不溶性淀粉、總酚、可溶性蛋白質和果膠含量均存在顯著性差異，當不溶性淀粉、總酚、可溶性蛋白質等沉淀敏感物質含量高時，體系較不穩定，而當果膠含量增加時，可以有效改善果汁體系的渾濁穩定性。隨著不斷后熟，蘋果中的不溶性淀粉逐漸轉化為可溶性單糖，同時總酚含量降低，果膠含量增加，使得后熟的蘋果濁汁渾濁穩定性更高。總體來說，選擇合適的品種和后成熟度可以有效提高NFC蘋果濁汁的渾濁穩定性。