石榴皮提取物對貯藏期間牦牛肉糜蛋白質氧化及揮發性風味物質的影響

李瓊帥，唐善虎*，李思寧，莫然，李錦錦，夏佳軍, 蔡寅川

1(西南民族大學 食品與科學技術學院，四川 成都，610041) 2(阿壩藏族羌族自治州工業經濟研究所，四川 阿壩藏族羌族自治州，624000)

牦牛生活在青藏高原及其鄰近的高海拔地區，牦牛肉一直被認為是良好的肉類來源，具有營養價值高、蛋白質含量豐富、脂肪含量低等優點[1]。牦牛肉糜是肉腸、肉脯、肉餅、肉餡、肉丸等多種產品的主要構成材料，牦牛肉糜加工成敗直接影響到這些產品的品質。但是，牦牛肉糜在貯藏過程中，產生的大量自由基攻擊蛋白質后會引起蛋白質氧化損傷，降低包括風味在內的肉的品質。據報道，許多植物提取物富含酚類物質，自由基清除能力強，可減少肉品在貯藏過程中的氧化損傷[2]。

石榴皮是石榴果實榨汁后的副產品，含有豐富的生物活性物質，如酚酸、類黃酮和水解單寧[3]，具有很好的自由基清除能力和抗氧化作用。研究表明，在冷藏牛肉丸中添加石榴皮提取物(pomegranate peel extract，PPE)后可抑制羰基的積累和疏基的損失，降低蛋白質的氧化程度[4]；在生豬肉餅中添加PPE，也具有良好的抗氧化作用及減少蛋白質的氧化損傷[5]。

目前，PPE在肉制品抗氧化、抑菌方面的研究報道較多，但是少有涉及到PPE對貯藏過程中牦牛肉糜二聚酪氨酸及色氨酸等蛋白質氧化情況和揮發性風味物質影響的研究。本研究以牦牛肉糜為研究對象，選用不同質量分數(下同)的PPE添加到牦牛肉糜中，以肌原纖維小片化指數(myofibrillar fragmentation index,MFI)、表面疏水性、二聚酪氨酸含量和色氨酸作為蛋白質氧化評價指標，同時采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用(head space solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)技術測定4 ℃貯藏過程中牦牛肉糜揮發性風味物質的變化情況，旨在為石榴副產物的開發利用和牦牛肉糜的保鮮提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉，紅原縣國中食品有限責任公司；石榴皮提取物40%鞣花酸(HPLC)(CSLP-C-A001940)，陜西嘉禾生物科技有限公司；

二丁基羥基甲苯(butylated hydroxy toluene,BHT)，上海源葉生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BR級)，上海如吉生物科技發展有限公司；溴酚藍、KCI、K2HPO4、KH2PO4、EDTA、MgCl2、NaC1、Na2HPO4、NaH2PO4，均為分析純成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

FSH-2A高速勻漿機，江蘇金壇市醫療儀器廠；紫外分光光度計，龍尼柯儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；九陽JYL-D05絞肉機，九陽股份有限公司；PL30型分析天平，梅特勒-托利多(上海)股份有限公司；TDZ5-WS離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；F-4700熒光分光光度計，日本株式會所日立高新技術科學那珂事業所；Trace DSQ型GC-MS聯用儀，美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牦牛肉糜制作

參照阮仕艷等[6]的方法，將解凍好的牦牛肉洗凈，除去可見脂肪與結締組織，切成小塊，用絞肉機(6 mm孔板)絞碎，將肉糜分成6個處理組，如表1所示。充分混合均勻后，將肉糜制成50 g的肉餅，每3個肉餅放入1個聚丙烯包裝盒中，用保鮮膜封好，置于4 ℃冰箱冷藏，分別在第1、3、6、9天測定各項指標，每次測定重復3次。

表1 肉糜處理組Table 1 Meat treatment group

1.3.2 MFI的檢測

參考鄭嬌等[7]的方法進行測定。稱取2 g牦牛肉糜，加入20 mL預冷的MFI緩沖液(100 mmol/L KCl、11.2 mmol/L K2HPO4、8.8 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2)，冰浴條件下勻漿(12 000 r/min，40 s，每次10 s，中間間隔10 s)，于1 000×g離心15 min(4 ℃)，棄掉上清液。在沉淀中加入15 mL預冷的MF1緩沖液將沉淀充分懸浮，再離心(1 000×g，15 min，4 ℃)，棄掉上清液。沉淀用7.5 mL預冷的MF1緩沖液充分懸浮后，用濾布過濾去除結締組織，再用7.5 mL預冷的MFI緩沖液沖洗離心管并過濾，合并濾液得肌原纖維蛋白懸浮液。采用雙縮法測定所得蛋白質濃度，再用MFI緩沖液調整蛋白質質量濃度至0.5 mg/mL，在540 nm處測定吸光度。所得結果乘以200即可得到MFI值。

1.3.3 表面疏水性的檢測

參照賈娜等[8]的方法加以修改。調蛋白液質量濃度為2 mg/mL，取1 mL蛋白溶液加入200 μL的1 mg/mL溴酚藍，混勻，然后離心15 min(6 000 r/min，4 ℃)。取上清液稀釋10倍，在595 nm處測定吸光值。表面疏水性以溴酚藍結合量表示，按公式(1)計算：

(1)

式中：A樣品，在595nm波長處測定吸光值；A空白，以磷酸緩沖液代替蛋白溶液進行相同操作測定值。

1.3.4 二聚酪氨酸的檢測

參考鄧思楊等[9]的方法加以修改。取2 mg/mL的蛋白溶液，利用F-4700熒光分光光度計測定熒光強度。其中，發射波長420 nm，激發波長325 nm，狹縫寬度均勻5 nm，電壓400 V。二聚酪氨酸含量表示為測得的吸光值除以蛋白濃度，為相對熒光值，單位為AU。計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A樣品，利用F-4700熒光分光光度計測定吸光度，為蛋白質溶液質量濃度，mg/mL。

1.3.5 色氨酸的檢測

參照李玲等[10]的方法加以修改。內源色氨酸熒光強度的變化通過F-4700熒光分光光度計進行檢測。調蛋白質量濃度為1 mg/mL，吸取3 mL置于熒光比色皿中，室溫條件下于283 nm處激發，記錄295～400 nm的發射光譜供后續分析。激發和發射狹縫寬度均設置為5 nm，電壓為400 V。

1.3.6 揮發性風味物質的檢測

參考張杰等[11]的方法，采用SPME-GC-MS法測定牦牛肉糜中的揮發性風味物質。稱取牦牛肉糜樣品2 g置于頂空瓶中，50 ℃下平衡30 min，SPME針頭萃取10 min后插入GC-MS進樣器，進樣口溫度220 ℃，解析時間10 min，收回纖維頭，拔出萃取頭。

GC條件：TG-WaxMS B色譜柱；載氣為氦氣。色譜柱起始溫度50 ℃保持2 min，以15 ℃/min升溫至100 ℃，再以5 ℃/min升溫至220 ℃，恒定流速為1.0 mL/min。

MS條件：EI離子源，電子能量為70 eV，GC-MS接口溫度220 ℃，質荷比掃描范圍45～450 amu。

結果經計算機自動檢索(NIST 08)進行定性分析，同時由Thermo Xcalibur 2.2軟件系統完成自動對照檢索，要求正反向匹配值均大于800；最后根據峰面積的相對含量(%)進行化合物的定量分析。

1.4 數據統計與處理

采用SPSS 18.0軟件進行數據統計處理、主成分分析與聚類分析，用ANOVA進行方差分析和顯著性分析，處理組之間的差異顯著性采用Duncan′s法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。用Origin 2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 PPE對貯藏期間牦牛肉糜MFI的影響

肌原纖維小片化是指肌原纖維在Z線附近斷裂成較短段的現象，MFI是根據1～4個肌節長的肌原纖維百分比計算的，反映了貯藏期間肌原纖維的結構完整性[12]。PPE對牦牛肉糜MFI的影響如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，各處理組MFI不斷增加且差異顯著(P<0.05)，表明肌原纖維和蛋白質結構的完整性遭到破壞，這可能與蛋白質氧化后肌原纖維間隙變大，接觸氧的機會更多，從而加劇小片化的速率有關[13]。0.01%BHT處理組的MFI在整個貯藏期內顯著低于空白對照組(P<0.05)。相反，0.01%、0.05%PPE處理組的MFI顯著高于空白對照組(P<0.05)，這可能是因為酚類化合物可誘導肌原纖維蛋白的結構改變，并導致肌原纖維小片化[14]。0.10%、0.20%PPE處理組的MFI顯著低于空白對照組(P<0.05)，0.20% PPE的添加量對貯藏期內MFI增加的抑制效果最好，可較好地維持肌原纖維的結構完整性，這可能是因為高濃度的PPE中羥基數量增加，與肌原纖維蛋白的反應活性增強，可以很容易地通過每個可能的結合位點與蛋白質相互作用，導致蛋白質交聯，同時，蛋白質的聚集可能導致肉糜形成更緊湊的結構，將肌原纖維中的水分排出，有助于MFI的降低。這與GAO等[14]的研究結果一致，即隨著多酚含量的增加，MFI增加；當多酚含量達到一定程度時，MFI降低。但CLAUSEN等[15]研究發現，在氧化環境下，蛋白質水解酶失活，蛋白質水解程度降低，MFI隨之降低。因此，MFI的變化可能是蛋白質氧化變性、PPE與蛋白質相互作用以及蛋白質水解酶綜合作用的結果。

圖1 PPE對牦牛肉糜MFI的影響Fig.1 Effect of PPE on MFI of yak minced meat 注：相同貯藏時間、不同處理組之間小寫字母不同表示 差異顯著(P<0.05)；不同貯藏時間、同一處理組大寫 字母不同表示差異顯著(P<0.05)(圖2、3同)

2.2 PPE對貯藏期間牦牛肉糜表面疏水性的影響

蛋白質表面疏水性是指與極性水環境接觸的蛋白質分子表面疏水基團的數量，與蛋白質分子的功能性質密切相關[16]，可以用來反映蛋白質的變性程度。表面疏水性越高，說明蛋白質分子內部的疏水性氨基酸殘基暴露越多，蛋白質氧化變性程度越大。如圖2所示，隨著貯藏時間延長，各處理組表面疏水性整體呈上升趨勢，表明在貯藏過程中，肉糜蛋白質不斷被氧化，引起結構改變，表面疏水性增大[17]。貯藏第1天，與空白對照組相比，0.01%PPE處理組的表面疏水性無顯著差異(P>0.05)，其余處理組均顯著低于空白對照組(P<0.05)。從第6天開始，各PPE處理組表面疏水性均顯著低于空白對照組(P<0.05)，其中，0.20%PPE處理組最低、效果最好，說明在牦牛肉糜中添加PPE后可抑制蛋白質氧化，降低蛋白質的變性程度。研究表明，甘草[18]、洋蔥皮[17]提取物也可減緩貯藏過程中蛋白質表面疏水性的增加，而貯藏過程中蛋白質分子間由于疏水相互作用形成的聚集物，會掩蓋原本的疏水位點，使表面疏水性降低[18]。然而，CAO等[19]研究發現，綠原酸在高濃度條件下可誘導肌原纖維蛋白表面疏水性進一步增加，促進氧化條件下蛋白質的進一步展開。

圖2 PPE對牦牛肉糜表面疏水性的影響Fig.2 Effect of PPE on the surface hydrophobicity of yak minced meat

2.3 PPE對貯藏期間牦牛肉糜二聚酪氨酸含量的影響

在蛋白氧化過程中酪氨酸容易被活性氧自由基氧化攻擊，產生的酪氨酸自由基和酪氨酸殘基可通過共價鍵和非共價鍵相互作用形成二聚酪氨酸[20]。因此，二聚酪氨酸含量可在一定程度上反映蛋白氧化程度和蛋白結構的變化，即二聚酪氨酸含量越高，蛋白質氧化程度越高，結構變化越大。如圖3所示，貯藏9 d內，各處理組的二聚酪氨酸含量顯著上升(P<0.05)，其中，空白對照組的上升幅度最大，從貯藏第1天的4.432 AU增加到貯藏第9天的6.675 AU，這可能是因為在貯藏過程中，蛋白質發生較嚴重的氧化反應，產生較多的酪氨酸殘基，彼此之間相互聚合導致二聚酪氨酸含量增加和蛋白結構變化。貯藏第3、6天，添加PPE后可顯著抑制牦牛肉糜中二聚酪氨酸含量的增加(P<0.05)。貯藏9 d結束時，0.20%PPE處理組二聚酪氨酸含量相比空白對照組降低27.63%且差異顯著(P<0.05)。與空白對照組相比，其他抗氧化劑處理組均能顯著抑制牦牛肉糜貯藏過程中二聚酪氨酸含量的增加(P<0.05)，表明PPE與BHT均有很好的抗氧化效果。綜上，添加0.20%PPE可抑制二聚酪氨酸含量的增加，效果最好。有研究表明，桑葚多酚[21]、生姜提取物[22]等具有抗氧化活性的物質均能抑制二聚酪氨酸含量的增加。但蛋白質在強氧化條件下，二聚酪氨酸含量會出現下降的情況，這可能是由于酪氨酸殘基被完全氧化，也可能是蛋白質分子發生交聯和聚集后，埋在蛋白質分子內部的二聚酪氨酸無法被檢測出來[23]。

圖3 PPE對牦牛肉糜二聚酪氨酸含量的影響Fig.3 Effect of PPE on the dityrosine content of yak minced meat

2.4 PPE對貯藏期間牦牛肉糜色氨酸的影響

色氨酸是一種重要的芳香族氨基酸，通常被包埋在蛋白質的內部，其吲哚環對環境非常敏感，因此可以作為蛋白質結構變化的指示物[24]。牦牛肉糜色氨酸熒光強度的變化如圖4所示，隨著貯藏時間的延長，各處理組的色氨酸熒光強度呈下降趨勢，在貯藏第9 d時達最低值。熒光強度降低的主要原因可能是氧化引起蛋白質三級結構被破壞，結構展開后導致更多疏水位點暴露，使得蛋白質溶解度降低和分子疏水聚集增強，因此熒光發射降低[25]。在貯藏期內，牦牛肉糜蛋白質不斷發生氧化，0.01% BHT處理組的熒光強度始終高于空白對照組，表明蛋白質側鏈中的熒光氨基酸被猝滅可能與蛋白質氧化有關。但是，蛋白氧化程度增加、其他氨基酸產生熒光干擾可能使色氨酸內源熒光強度增大[23]。在牦牛肉糜中添加PPE后，引起色氨酸熒光強度降低，且添加量越大，熒光強度越低，這表明PPE與牦牛肉糜蛋白可能發生相互作用，使得蛋白質的空間結構展開，色氨酸等熒光基團暴露在極性環境中，使得熒光強度降低。多酚與蛋白質的相互作用方式包括共價鍵和非共價鍵，如二硫鍵、疏水相互作用、氫鍵等[26]。研究表明，蘆丁[27]、表兒茶素[28]、綠原酸[19]等多酚均會引起色氨酸熒光強度的降低。

2.5 PPE對貯藏期間牦牛肉糜揮發性風味物質的影響

2.5.1 不同處理組牦牛肉糜的主成分分析

牦牛肉糜在4 ℃貯藏期間生成揮發性風味物質的主要途徑是脂肪氧化、酶和微生物作用。由表2可知牦牛肉糜中共檢測出九類揮發性風味物質，包括酸類(8種)、烴類化合物(31種)、醇類(28種)、酚類(3種)、醛類(12種)、醚類(5種)、酮類(9種)、酯類(13種)。

由于構成牦牛肉糜揮發性風味物質的種類較多，因此采用主成分分析法來簡化數據，一般當特征值大于1和累計貢獻率>70%時就可作為主成分[29]。如表3所示，經主成分分析提取的3個主成分，其特征值均大于1，累計方差貢獻率為73.812%，基本反映了所有變量的初始信息，因此，選用前3個主成分作為數據分析的有效成分。

各主成分的載荷值代表該主成分對該類物質反映程度的大小[30]，本次研究中采用載荷的絕對值大于0.6為判斷依據[29]。由表4可知構成PC1的是酸類、雜環及其他類、醛類、醇類、酮類、醚類；構成PC2的是酚類、烴類；構成PC3的是酯類。

A-貯藏第1天；B-貯藏第3天；C-貯藏第6天；D-貯藏第9天圖4 PPE對牦牛肉糜色氨酸熒光強度的影響Fig.4 Effect of PPE on the tryptophan fluorescence intensity of yak minced meat

表2 貯藏過程中揮發性風味物質類別及相對含量變化Table 2 Changes in the types and relative contents of volatile flavor substances during storage

表3 主成分的特征值和貢獻率Table 3 Eigenvalue of the principal components and their contribution rates and cumulative contribution rates

表4 主成分的特征向量與載荷矩陣Table 4 Principal component eigenvectors and loading matrix

2.5.2 不同處理組牦牛肉糜揮發性成分綜合評價模型的建立

根據3個主成分九類物質各自的特征向量，計算各主成分得分，用F1、F2和F3表示，公式如下：

F=0.395F1+0.178F2+0.164F3

F1=-0.291X1+0.215X2+0.234X3-0.179X4+0.221X5+0.143X6+0.051X7-0.008X8-0.005X9

F2=0.142X1+0.022X2-0.258X3-0.162X4+0.015X5+0.299X6-0.493X7+0.433X8+0.031X9

F3=-0.205X1-0.101X2-0.004X3+0.180X4+0.407X5-0.239X6+0.076X7+0.232X8+0.566X9

式中：X1～X9分別對應酸類、雜環及其他類、醛類、醇類、酮類、醚類、酚類、烴類、酯類9個類別。

以3個主成分對應的方差貢獻率作為加權系數，得到主成分綜合評價模型：

如表5所示，0.05%PPE處理組在貯藏第1、3天時揮發性成分品質最好，其次是貯藏第1、3天的0.20% PPE處理組，空白對照組在貯藏第3天時揮發性成分品質最好，排名第3。在貯藏第1、9天時，空白對照組樣品的綜合排名均低于各PPE處理組，說明在牦牛肉糜中添加不同質量分數的PPE后可有效改善其揮發性成分品質。隨著貯藏時間的YANCHANG ，各處理組綜合排名整體呈逐漸下降趨勢，表明肉糜新鮮度下降，品質降低，微生物活動、蛋白質和脂肪氧化以及酶的作用都是引起肉品腐敗，導致新鮮度降低的重要因素。整體來看，0.01%、0.05%PPE處理組揮發性成分品質最好，0.10%、0.20%PPE處理組揮發性成分品質適中，空白對照組和0.01%BHT處理組揮發性成分品質最差。

表5 不同處理組牦牛肉糜成分得分及綜合評估Table 5 Principal component scores and comprehensive assessment of minced yak meat in different treatment groups

2.5.3 不同處理組牦牛肉糜的聚類分析

采用SPSS 18.0軟件，采用類組間連接法，以牦牛肉糜中檢測出的九類揮發性風味物質為依據，對6個處理組、4個貯藏時間點共計24個牦牛肉糜樣品進行聚類分析，建立聚類樹狀圖，結果見圖5，樣品序號同表2。當歐式距離為20時，24個樣品可以聚為三類。在貯藏第1、3天的樣品中，1號樣品單獨聚為一類，排名在11位，其余樣品聚為一類；除5號樣品排名在第17位外，其余樣品排名在1～10位。貯藏第6、9天的樣品，排名在12～24位，聚為一類。對比表5及圖5結果發現，聚類分析與主成分分析結果具有一致性，即在貯藏第1、3天，各處理組牦牛肉糜新鮮度高，揮發性風味物質相對含量相似，綜合排名靠前，可聚為一類；隨著貯藏時間延長，牦牛肉糜新鮮度降低，綜合排名靠后，聚為一類。

圖5 二十四個牦牛肉糜樣品的聚類分析譜系圖Fig.5 Dendrogram of HCA of 24 minced yak meat samples

3 結論

在牦牛肉糜貯藏過程中，較低的PPE添加量(0.01%、0.05%，質量分數)會增加其MFI，較高的PPE添加量(0.10%、0.20%，質量分數)則會降低其MFI。另外，PPE可抑制牦牛肉糜表面疏水性和二聚酪氨酸含量的增加，降低牦牛肉糜蛋白質氧化和結構變化的程度，但PPE中的酚類物質會引起色氨酸熒光強度的降低。通過主成分分析提取了3個主成分，PPE有助于牦牛肉糜風味的改善，提高牦牛肉糜的綜合得分。聚類分析結果反映出貯藏過程中牦牛肉糜新鮮度不斷降低。綜合來看，PPE添加量為0.20%可有效抑制牦牛肉糜貯藏過程中蛋白質的氧化程度，改善風味，效果最好。該研究結果為PPE的進一步開發利用和牦牛肉糜的新型保鮮方法提供了一定的理論依據。