鐵堅油杉在NaHCO3脅迫下的生理響應機制

裴春艷，顏玉娟，顏立紅,田曉明，向光鋒

(1. 中南林業科技大學 風景園林學院,湖南 長沙 410004；2.湖南省自然保護地風景資源大數據工程技術研究中心，湖南 長沙 410004；3. 湖南省植物園,湖南 長沙 410116)

1 引言

根據聯合國教科文組織和糧農組織不完全統計，全世界鹽堿地面積約9.5438億hm2，其中我國為9913萬hm2[1]。2022年中央一號文件《中共中央國務院關于做好2022年全面推進鄉村振興重點工作的意見》中提出：研究制定鹽堿地綜合利用規劃和實施方案；分類改造鹽堿地，推動由主要治理鹽堿地適應作物，向更多選育耐鹽堿植物適應鹽堿地轉變。表明選育耐鹽堿植物是今后治理鹽堿的重要方向之一。我國鹽堿地面積大，分布范圍廣，類型多樣[2]，改善鹽堿地具有極大的潛在價值。目前關于鹽堿地的改良措施中生物措施是最具生態、經濟效益的措施[3]，生物措施包括植物種植和微生物改良，在鹽堿地上種植綠色植被能夠大大改善生態環境。不同植物對鹽堿脅迫的耐受程度不同，所以探究鹽堿脅迫對植物的影響，了解植物響應機制，對于篩選耐鹽植物及開發鹽堿地具有重要意義。

鐵堅油杉(Keteleeriadavidiana(Bertr.) Beissn.)為松科( Pinaceae)油杉屬(Keteleeria)常綠喬木，為我國特有樹種，產于我國甘肅、陜西、四川、湖北、湖南、貴州、廣西、云南等省區宜生于砂巖、頁巖或石灰巖山地[4]，為湖北省省級珍貴植物[5]。鐵堅油杉是一種適應范圍較廣的亞熱帶地區優良鄉土樹種，對土壤要求不高，具有菌根，可改良土壤，還能抗干旱、雪壓和風折[6]。鐵堅油杉適應環境能力較強，能適應生長在干熱河谷的特殊氣候和土壤條件中[7]，這說明其耐旱性強。各種優良的特性使得探究鐵堅油杉的耐鹽性具有一定的研究價值。本研究通過盆栽試驗法對鐵堅油杉進行堿性鹽NaHCO3處理，探討了鐵堅油杉在NaHCO3脅迫下的生理響應機制，以期得到大概的耐鹽范圍，為其引種、推廣和應用提供參考。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

試驗材料使用的是湖南省植物園3年生鐵堅油杉地栽苗，于2020年11月份上盆于規格一致的花盆(內徑22.5 cm，高24 cm)，栽培基質每盆干重3 kg，基質配比為黃心土∶泥炭土∶珍珠巖，體積比3∶1∶1，每盆種植苗木1株。上盆的試驗苗放于湖南省植物園苗圃，正常水肥管理至次年7月份。

2.2 試驗設計

2021年7月2日在上盆的鐵堅油杉中挑選無病蟲害、長勢好的植株，運至湖南省植物園溫室內進行緩苗，待適應環境后開始試驗。采用完全隨機試驗設計，根據預試驗結果，設置了5個不同NaHCO3濃度處理：0%(CK)、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，每個處理5盆，每盆1株苗。7月12日正式開始試驗，于當天采樣后對每盆試驗苗采用澆灌法進行相應鹽分濃度處理，鹽分濃度采取質量百分比配置(0.1% NaHCO3配比為鹽∶水=1∶999)，盆底設有托盤，將滲漏的水倒回盆內防止鹽分流失(試驗期間所用水均為去離子水)。試驗共40 d，于第0 d開始采樣測試，后每隔10 d采一次樣，共5個周期。各周期的采樣時間在每天的8:00～9:00，隨機采樣，指標測試時設置3個重復。

2.3 試驗指標測定方法

2.3.1 生長指標測定

形態觀測：每5 d進行植株形態觀測，每10 d進行拍照記錄植株形態上的變化。

株高增長測量：分別在試驗0 d和40 d使用精度0.1 cm卷尺測量植株高度。

地徑增長測量：分別在試驗0 d和40 d使用精度0.01 mm游標卡尺測量植株莖粗。

2.3.2 生理指標測定

采樣烘干稱重法測量葉片相對含水量[9]。計算公式為：

相對含水量RWC(%)=(自然鮮重-干重)/(飽和鮮重-干重)×100%

(1)

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)光化學還原法測定[9]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測定[10]；脯氨酸(Pro)采用磺基水楊酸法測定[11]；可溶性蛋白(SP)含量采用考馬斯亮藍G-250法測定[12]；光合色素含量采用分光光度法測定[12]。

2.4 數據處理與分析

數據使用Microsoft Excel 2019整理，采用SPSS 22.0系統分析軟件對數據進行方差分析，用Origin 2017軟件進行作圖。

3 試驗結果與分析

3.1 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉形態和生長指標的影響

試驗期間進行觀察拍照記錄發現，NaHCO3處理的植株鹽害癥狀表現為植株葉片失水干枯，掛枝頭不脫落，直至植株死亡后掉落。植株鹽害癥狀整體變化趨勢：由外至內、由新生葉至老葉。0.5%和1.0%處理組植株均正常生長與CK無差別；1.5%處理組植株在試驗期間無鹽害癥狀，試驗結束后25 d有2株植株的新生成熟葉片出現鹽害癥狀，后隨觀察時間的延長，試驗結束后30 d有2株植株鹽害癥狀加劇，新生葉片干枯，2株植株出現輕微鹽害癥狀，枝頭新生葉片葉色變淡，其余的正常；2.0%處理組下植株有2株在試驗30 d時出現輕微鹽害癥狀，后隨脅迫時間延長該處理組下的植株均出現鹽害癥狀，試驗結束后30 d有1株出現死亡。堿性鹽NaHCO3處理的植株鹽害癥狀表現如圖1、2。

圖1 鐵堅油杉局部觀察

圖2 鐵堅油杉整株觀察

根據表1分析，隨鹽濃度的增加，株高增長量先增加后減少，地徑增長量逐漸減少，其中0.5%處理組株高增長量相較CK增加了23.8%；2.0%處理組下的株高與地徑增長量顯著低于CK(P<0.05)，分別較CK下降56.2%和54.8%。這表明0.5%NaHCO3處理下對鐵堅油杉的生長有促進作用，但濃度高于1.5%的鹽脅迫抑制了植株生長，濃度越大抑制作用越強。

表1 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉株高和地徑的影響

3.2 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉生理指標的影響

3.2.1 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉葉片相對含水量(RWC)的影響

根據圖3分析，試驗至20 d時，2.0%處理組RWC顯著低于CK(p<0.05)，且隨脅迫時間的延長與CK組差距越來越大，至40 d時該處理組葉RWC極顯著低于CK(p<0.01)。1.5%處理組在試驗40 d時RWC顯著低于CK；其他處理組均勻CK無顯著區別。表明NaHCO3脅迫下，濃度超過1.5%的處理組造成了植株水分代謝失衡。這可能是由于高濃度鹽環境下滲透脅迫和高pH脅迫共同影響導致根系吸收困難，水分難以供應到植株上部分的枝葉，故試驗后期高濃度梯度組RWC顯著低于CK。

圖3 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉葉片相對含水量的影響注：不同小寫字母表示同一時間不同處理間的差異顯著性(P< 0.05),下同

3.2.2 丙二醛(MDA)含量

根據圖4分析，各鹽脅迫處理組MDA含量整體隨脅迫時間的延長呈逐漸遞增的變化趨勢；在同一周期內，MDA含量隨鹽濃度的增加而增加。試驗至10 d，除2.0%處理組MDA含量顯著高于CK(p<0.05)，其余處理組均與CK組無顯著相關性(p>0.05)。試驗至20 d，除0.5%處理組MDA含量與CK無顯著相關性，其余處理組均顯著或極顯著高于CK。脅迫至30 d和40 d時，1.5%和2.0%處理組MDA含量均極顯著高于CK(p<0.01)，其余處理組與CK無顯著相關性。

圖4 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉葉片丙二醛含量的影響

3.2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性

根據圖5分析，各鹽脅迫處理組SOD活性整體隨脅迫時間的延長呈先增加后減小的變化趨勢。試驗至10 d，各鹽脅迫處理組SOD活性均高于CK，但無顯著相關性(p>0.05)；試驗至20 d，除0.5%處理組SOD活性低于CK，其他處理組均高于CK，其中1.5%和2.0%處理組與CK呈顯著相關性(p<0.05)；試驗至30 d，1.0%和1.5%處理組SOD活性顯著高于CK(p<0.05)，2.0%處理組SOD活性顯著低于CK(p<0.05)；試驗至40 d，各處理組SOD活性均低于CK，其中1.0%和2.0%處理組與CK存在顯著相關性(p<0.05)。

圖5 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉葉片SOD活性的影響

3.2.4 脯氨酸(Pro)含量

根據圖6分析，各鹽脅迫處理組Pro含量隨試驗時間的延長整體呈增加的變化趨勢。試驗至10 d，0.5%和1.0%處理組Pro含量低于CK，1.5%和2.0%處理組高于CK，但無顯著相關性(p>0.05)；試驗至20 d，各鹽脅迫處理組Pro含量均高于CK，無顯著相關性；試驗至30 d，各處理組均高于CK，其中2.0%處理組與CK呈顯著相關性(p<0.05)；脅迫至40 d，隨鹽濃度的增加Pro含量呈逐漸增加的變化趨勢，其中1.0%處理組顯著高于CK(p<0.05)，1.5%和2.0%處理組均極顯著高于CK(p<0.01)。

圖6 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉葉片脯氨酸含量的影響

3.2.5 可溶性蛋白(SP)含量

根據圖7分析，試驗至10 d，各處理組SP含量均高于CK；試驗至20 d，各處理組SP含量隨鹽濃度的增加而增加，其中1.5%和2.0%處理組極顯著高于CK(p<0.01)；試驗至30 d，各處理組SP含量隨鹽濃度的增加先增加后減少，其中2.0%處理組與1.5%處理組呈顯著相關性(p<0.05)；脅迫至40 d，1.0%處理組SP含量達到最大，2.0%處理組SP含量小于CK，與1.0%處理組呈極顯著相關性(p<0.01)。

圖7 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉葉片可溶性蛋白含量的影響

3.2.6 葉綠素a含量

根據表2分析，CK、0.5%和1.0%處理組葉綠素a含量隨脅迫時間的延長整體呈增加的變化趨勢，1.5%和2.0%處理組則先增加后減少。試驗至10 d，各鹽處理組的葉綠素a含量均高于CK，但無顯著相關性(p>0.05)；試驗至20 d，1.5%和2.0%處理組葉綠素a含量均顯著高于CK(p<0.05)；試驗至30 d，2.0%處理組葉綠素a含量顯著低于CK(p<0.05)，其他處理組均高于CK但無顯著相關性；試驗至40 d，各項葉綠素a含量隨鹽濃度的增加先增加后減少，其中1.5%處理組葉綠素a含量顯著低于CK(p<0.05)，2.0%處理組葉綠素a含量極顯著低于CK(p<0.01)，其他處理組均高于CK。

表2 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉葉片葉綠素a含量的影響

4 討論與結論

4.1 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉生長指標的影響

不同的植物對鹽堿的耐受能力不一樣，當土壤鹽分超過植物的耐受能力會抑制植物的生長，嚴重的話會造成植物死亡。植物受到鹽害最直觀的表現是葉、莖等表觀形態的變化。本研究中鐵堅油杉在高濃度NaHCO3脅迫表現了明顯的鹽害反應，葉出現失水現象，后隨脅迫時間延長干枯，最終致植物死亡。鐵堅油杉在生長中也受到了抑制，地徑增長量隨鹽濃度的增加逐漸減少，2.0%處理下株高和地徑增長量都顯著的低于CK。有研究[13]指出生物在受到脅迫或傷害會出現補償現象，這是生物對不良環境的一種適應，這種補償生長效應是植物抵御逆境危害的一種自我體內調節機制。本研究中在0.5%濃度脅迫下株高增長量高于CK，之后隨鹽濃度的增加而下降，表現出‘低促高抑’現象，這與周貝寧[14]研究夏臘梅在堿性鹽脅迫下的生長結論一致。

4.2 NaHCO3脅迫對鐵堅油杉生理指標的影響

鹽堿化土壤會對植物造成滲透脅迫、離子毒害以及活性氧傷害，同時伴隨著高pH值的傷害[15]。而植物在生長過程中應對逆境條件形成一系列的生理響應機制，主要包括合成滲透調節物質、離子區隔化、提高抗氧化酶活性清除活性氧等生理機制。脯氨酸、可溶性蛋白是重要的滲透調節物質，在植物受到脅迫時會增加其含量來抵御不利的生長條件[16]。SOD是保護酶系統中最重要的酶之一，起到清除活性氧的作用，而MDA是植物遭受逆境脅迫后膜脂過氧化的重要產物，MDA含量可以反映植物受傷害程度[17]。鹽脅迫下會對植物的光合系統造成損害，葉綠素作為光能吸收、傳遞和轉化的主要物質載體，在光合作用中占有重要地位[18]，葉綠素a的含量可以反應植物在鹽脅迫下的傷害情況。本研究中，鐵堅油杉在不同濃度NaHCO3脅迫下生理指標變化各不相同。滲透調節物質脯氨酸含量隨脅迫時間的延長逐漸增加，在同一時間內也隨濃度的增加而增加；可溶性蛋白含量隨時間濃度的增加先增加后減少。表明鐵堅油杉在鹽脅迫下能合成滲透調節物質來抵御外界的滲透壓，保證植物的吸水，維持正常生長。但隨脅迫時間的延長，活性氧的增加植物已難以清除過多的活性氧來維持平衡，有害離子在植株體內增加，造成活性氧增多累積，從而導致可溶性蛋白被分解，故試驗后期高濃度可溶性蛋白含量減少。試驗初期，少量的活性氧能被植物體內的抗氧化酶清除，本研究中植株試驗前期提高SOD活性清除活性氧，隨脅迫時間延長高濃度SOD活性明顯下降，原因是過量的活性氧破壞了酶的結構。活性氧的增加破壞了細胞膜，使得MDA含量也在不斷增加，本試驗中MDA含量隨脅迫時間和濃度的增加不斷增加，其中高濃度的MDA含量顯著高于CK，表明高濃度鹽脅迫破壞了植株體內的細胞膜和膜的選擇透性功能。NaHCO3脅迫也造成了鐵堅油杉光合作用受到影響，試驗開始時高濃度組葉綠素a含量較CK組高，試驗后前高濃度組的葉綠素a合成明顯受到抑制，顯著低于CK。表明鐵堅油杉在脅迫前期通過合成葉綠素a來增加光合作用，提高植物的有機物積累，從而抵御逆境脅迫，但隨后活性氧的增加及MDA的毒害造成葉綠素a合成受到抑制。

綜上所述，鐵堅油杉對NaHCO3有一定的耐性，能耐低于1.0%質量濃度下的NaHCO3脅迫。但濃度超過1.5%短時間內能通過增加滲透調節物質，提高抗氧化酶活性等生理機制來適應脅迫環境，但長時間的脅迫還是會影響鐵堅油杉的生長。