燕麥根腐病拮抗菌的篩選及抑菌特性研究

金艷麗，姚 拓，蘭曉君，李昌寧，馬亞春

(甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

燕麥(AvenasativaL.)是一種糧飼兼用的世界性栽培作物，作為優質飼料，其具有可消化纖維含量高，適口性好，易青貯等特點，在畜牧業發展方面發揮著重要作用[1]，作為營養保健食品，具有降壓降糖降膽固醇、改善血液循環的功效，可維護人體的正常機能[2-3]。隨著近年來人們對燕麥營養價值的研究不斷深入,燕麥需求量和種植面積逐年增加，燕麥病害也大面積的發生。根腐病是植物病害中危害最嚴重的土傳根部病害之一，該病極易感染、發生范圍廣，嚴重時可導致作物減產甚至絕收。由鐮刀菌引起的燕麥根腐病在國內大多數省份均有出現，嚴重影響了燕麥的產量和品質。目前根腐病的防治的主要依靠化學農藥，長期不合理的施用化學農藥，引發了人民對食品安全的擔憂，并造成土壤環境污染等問題，此外部分農藥能殺死土壤中有益微生物，破壞了植物根際微生境，造成作物減產等問題[4]。2015年，我國制定了化肥、農藥使用零增長計劃，使得尋求安全無污染的作物病害防治措施成為當今研究的熱點之一[5]。

生物防治是一種安全有效且對環境友好的病害防治途徑[6]。在植物根際土壤和植物體內分布著種類繁多的有益微生物，包括細菌、真菌和放線菌等，這些微生物能夠通過多種直接或間接機制對植物的生長產生積極作用，其中生防細菌作為根際微生物中重要的類群，在植物病害的生物防治中被廣泛研究[7]，生防細菌在與植物協同進化過程中形成互利共生關系，通過拮抗、競爭、誘導等方式發揮其生防特性[8]。生防細菌在作物根腐病上的防治已有較多報道，例如，趙曉霞[9]等從鹽堿土壤中分離出一株枯草芽孢桿菌，對黃芪根腐病具有良好的防治作用；劉莎莎[10]等從紫花苜蓿根際土壤中分離出2株芽孢桿菌，對紫花苜蓿根腐病有較好的防治效果；郭榮君[11]等利用芽孢桿菌制成的菌劑對小麥根腐病的防治效果可達46.8%。目前，國內針對燕麥根腐病的生物防治研究報道較少。因此，分離篩選可以抑制燕麥根腐病的生防菌株并對其特性進行研究，對燕麥根腐病防治具有極其重要的現實意義。

課題組前期以燕麥根腐病病株為材料，分離出5株致病真菌并進行了致病性測定和分類學鑒定，其中以禾谷鐮刀菌致病性最強[12]。篩選對燕麥根腐病具有防效的生防菌是實現該病害生物防治的前提，探究其生防特性可為植物生物防治提供理論基礎，本研究擬從生長健康的燕麥根際分離生防菌，并將課題組前期篩選出的生防菌株納入研究對象，通過拮抗實驗篩選出對禾谷鐮刀菌致病性有明顯抑制作用的菌株，測定其生防特性以及代謝產物的抑菌活性，確定菌株的主要抑菌作用，評估菌株的生防潛力，以期為燕麥根腐病的生物防治提供優良的菌種資源，為燕麥的綠色可持續生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試植物材料 燕麥植株：2020年5月采自甘肅省通渭縣燕麥種植大田(105°24819′E，35°24558′N，海拔高度2 293 m)，采用五點取樣法，選擇長勢良好的健康植株，將根連同根系土壤完全混合，裝入無菌自封袋中，低溫運輸至實驗室，48 h內進行樣品處理。

1.1.2供試菌株 供試病原菌：禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、茄鏈格胞菌(Alternariasolani)，由甘肅農業大學草地微生物實驗室提供。

供試生防菌：菌株CCM、LM-1、LSH11、TQF-1、TQF-2、TQF-3、TZF-1，由甘肅農業大學草地微生物實驗室提供。

1.1.3培養基 LB培養基；PDA培養基；鉻天青(CAS)培養基；蛋白酶檢測培養基；纖維素酶檢測培養基：淀粉酶檢測培養基；脂肽發酵培養基[13-17]。

1.2 方法

1.2.1生防菌的分離與純化 抖落燕麥根系附著的土壤，稱取根系及其根際土壤分別加入盛有無菌生理鹽水的三角瓶中，搖床震蕩30 min(180 r·min-1)，靜置幾分鐘后吸取1 mL菌懸液加入盛有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，制得濃度為10-1的稀釋液，再依次稀釋制得10-2，10-3，10-4，10-5梯度稀釋液，將各梯度進行涂布，放入30℃恒溫培養箱中培養24 h。待平板長出單菌落后，挑取單菌落進行純化培養，4℃保存備用。

1.2.2菌株初篩 采用平板對峙法[18]，以禾谷鐮刀菌為指示菌，點接于PDA培養基中央，采用十字交叉法將分離的菌株點接于距培養基中心位置2 cm處，以單接病原菌的平板做對照，在30℃的條件下恒溫培養3～5 d，待對照的真菌長滿平板后，測量抑菌帶寬度，每個處理做3次重復，挑選抑菌效果較好的菌株進行編號并保存。

1.2.3抗菌譜的測定 將初篩的拮抗菌株分別與尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、茄鏈格胞菌3種病原菌進行平板對峙,將病原菌點接于PDA培養基中央，將拮抗菌以十字交叉法點接于距培養基中心位置2 cm處，以只接病原真菌的處理做對照，在30℃的條件下恒溫培養3～5 d，待對照的真菌長滿平板后，測量抑菌帶寬度，每組處理3次重復。

抑菌率(%) =(對照菌落直徑-處理菌落直徑) /對照菌落直徑×100%。

1.2.4嗜鐵素的定性和定量測定 定性測定：將初篩菌株點接于鉻天青檢測培養基中心位置，在28℃下培養3～5 d，觀察菌株周圍是否有黃色暈圈的產生。每個處理3次重復，根據黃色暈圈的大小，篩選出產嗜鐵素能力較強的菌株進行產嗜鐵素的定量測定。

定量測定參照何翔[19]的方法：將產生較大暈圈的菌株接入無鐵查氏液體培養基，在28℃,150 r·min-1的條件下培養48 h后，取4 mL菌液用0.22 μm的無菌濾膜過濾后，加入等體積的CAS檢測液混合，靜置1 h后測定其在 630 nm下的波長，記作“As”，空白培養基的OD630作為做對照，記作“Ar”。每組重復3次，計算出嗜鐵素的相對含量：

Su=(Ar-As)/Ar×100%

1.2.5溶菌酶的定性測定 纖維素酶的定性：采用剛果紅顯色法，將菌株點接于纖維素酶檢測培養基，每個處理3次重復，放入培養箱30℃培養2天后，取出培養基加入1 mg·mL-1的剛果紅染液，染色1 h后倒掉染液，再加入1 mol·L-1的氯化鈉溶液脫洗30 min，倒掉溶液后觀察菌體周圍是否有脫色圈的產生。

蛋白酶的定性：用接種環將純化好的拮抗細菌接種在蛋白酶檢測培養基平板上，每個處理3次重復，放入培養箱中30℃培養 72 h，觀察是否有透明圈的產生。

淀粉酶的定性:用接種環將純化好的拮抗細菌點接于配置好的培養基平板，每個處理3次重復，于37℃條件下倒置培養7 d后，取出培養皿加入1 mg·mL-1的碘液，讓其顯色1 h后倒掉培養皿中的碘液。觀察菌體周圍是否有脫色圈形成。

1.2.6溶菌酶的定量測定 根據產酶特性對拮抗菌株進行復篩，將產生透明圈較大的菌株進行定量測定，蛋白酶的定量測定采用福林酚法，纖維素酶和淀粉酶的酶活力的定量采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[20]。

1.2.7脂肽類物質的提取及其抑菌活性檢測 利用酸沉淀法，將菌液上清液用鹽酸沉淀，用甲醇少量多次的萃取，最后利用旋轉蒸發儀進行蒸發，得到脂肽類粗提物[21]。采用濾紙片法測定脂肽粗提物的抑菌譜[22]。將真菌接在PDA平板中央，在距離真菌2.5 cm處的等角放置3個滅菌濾紙片，吸取10 μL脂肽粗體物于濾紙片上，以等量無菌水作對照，在30℃的條件下恒溫培養3～5 d，待對照的真菌長滿平板后，測量抑菌帶寬度，每組處理3次重復。

1.2.8菌株的鑒定 采用16S rDNA基因序列分析法，用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)提取DNA，利用生工生物工程股份有限公司合成16S rDNA通用引物27F/1492r。合格后送北京奧科生物有限公司測序。在EZBiocloud網站(www.ezbiocloud.net/) 用16S-based ID進行比對分析，選擇序列相近模式菌株的16S rDNA序列下載，用MEGA 7.0.17軟件，以鄰近法構建系統進化樹。

1.3 數據處理

采用Excel 2007進行數據整理及制圖,采用SPSS 24.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 生防菌的分離篩選

燕麥根系和根系土壤共分離純化出23株細菌，通過平板對峙實驗，篩選出4株對禾谷鐮刀菌有較強抑制作用的菌株，其中2株分離自燕麥根系，2株分離自根際土壤。實驗室前期分離的7株生防菌對禾谷鐮刀菌都有較強的抑制作用，因此總共篩選出11株(表1)可以抑制禾谷鐮刀菌的菌株，用于后期生防潛力的測定。

表1 菌株編號及來源Table 1 Strain number and source

2.2 菌株抑菌譜的測定

對11株拮抗菌株進行抑菌譜測定。發現11株菌對三株病原菌都有不同程度的抑制作用，對所測病原菌抑菌范圍在41%～73%之間，其中對禾谷鐮刀菌抑制效果最強的菌株是R1,抑菌率達到72.92%，對茄鏈格孢菌抑菌效果最明顯的是菌株TZF-1，抑菌率達到73.5%，對尖孢鐮刀菌抑菌效果最好的是菌株CCM，抑菌率達到69.22%。其中TZF-1、CCM、R1、LSH11的抑菌效果較好，抑菌率均達到67%以上(表2)。

表2 不同拮抗細菌對致病菌的抑菌活性Table 2 Antifungal effects of antagonistic bacteria on pathogens

2.3 鐵載體的定性與定量測定

對菌株進行鐵載體定性測定，培養5 d后發現有4株菌周圍出現較大的黃色暈圈(圖1)，其他菌株暈圈較小或沒有暈圈，表明這4株菌分泌鐵載體的活性最強，因次將這4株復篩菌株進行產鐵載體能力的定量測定(表3)，鐵載體活性最高的是LSH11，鐵載體活性為68.26%，其次是R1，鐵載體活性為59.57%，CCM產鐵載體能力最弱，各菌株分泌鐵載體的能力差異顯著。

圖1 CAS藍色平板檢測結果Fig.1 Test results of siderophore production in the CAS blue plates

表3 不同拮抗細菌產鐵載體的能力Table 3 Siderophore-producing activity of antagonistic bacteria

2.4 水解酶的定性測定

利用選擇性培養基檢測生防菌分泌幾種酶的活性，產生透明圈代表菌株次生代謝物中含有相應的酶，透明圈較大的處理代表產酶能力較強，以產生透明圈大小為指標，復篩出綜合產酶能力較強的4株菌，這幾株菌能同時在不同的培養基上能夠產生較大的透明圈(圖2)，后續用于酶活性的定量測定。

2.5 水解酶的定量測定

篩選出的4株可同時產蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶的生防菌，對其進行定量測定，結果如下(表4)，菌株R1產蛋白酶能力最強，蛋白酶活性可達70.12 U·mL-1，顯著高于其他菌株，菌株CCM產纖維素酶能力最強，纖維素酶活性可達22.28 U·mL-1，顯著高于其他菌株，菌株LSH11產淀粉酶能力最強，淀粉酶活性可達167.26 U·mL-1，顯著高于其他菌株，各菌株之間產酶能力差異顯著。

圖2 淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶平板檢測Fig.2 Plate detection of amylase,cellulase and protease

表4 不同拮抗細菌的水解酶活性Table 4 Hydrolase activity of antagonistic bacteria

2.6 脂肽類物質的提取及其抑菌活性檢測

脂肽粗提物對禾谷鐮刀菌有明顯的抑制作用，其中菌株R1的抑菌效果最好，抑菌率達到63.92%，顯著高于其他菌株，菌株LSH11對茄鏈格孢菌的抑制率最高，抑菌率可達68.65%，顯著高于其他菌，菌株R1和LSH11對尖孢鐮刀菌的抑制作用最強，抑菌率高于50%，顯著高于菌株CCM和TZF-1。

表5 脂肽粗提物對致病菌的抑制作用Table 5 Inhibitory effect of lipopeptide roughty on pathogenic bacteria

2.7 菌株的鑒定

將測序結果在EzBioCloud上用16S-based ID進行比對分析，發現與菌株R1親緣關系最近的菌為貝萊斯芽孢桿菌，用MEGA 7.0.17軟件，鄰近法構建系統進化樹，菌株R1和貝萊斯芽孢桿菌構成一個分支，結合形態學分析，初步鑒定菌株R1為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，根據比對結果和進化分析，結合形態學分析，鑒定菌株LSH11為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，菌株TZF-1萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophatus),菌株CCM為皮爾瑞俄類芽孢桿菌(Paenibacilluspeoriae)。

圖3 菌株16SrDNA基因序列同源性構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed by homology of 16SrDNA gene sequences

3 討論

本研究以燕麥根腐病的致病菌禾谷鐮刀菌為靶標菌，篩選出11株對禾谷鐮刀菌有明顯抑制作用的生防菌，抑菌率為47.5%～72.92%，同時對尖孢鐮刀菌和茄鏈格孢菌也有較強的抑制作用，抑菌率為41.02%～73.5%，說明這幾株菌具有廣譜抑菌性。但是將平板對峙實驗結果作為生防菌篩選的主要依據具有一定的局限性[23]，結合生防機制進行生防菌的篩選，可以提供菌株在生防應用中的理論依據并增加菌株生防成功的可能性[24]，本研究結合菌株分泌鐵載體、纖維素酶、蛋白酶等生防特性，對菌株進行了復篩，篩選出4株綜合特性良好的菌株，經鑒定分別是枯草芽孢桿菌，貝萊斯芽孢桿菌，萎縮芽孢桿菌和皮爾瑞俄類芽孢桿菌。芽孢桿菌作為微生態環境中的優勢種群，因其抗逆性極強，抑菌范圍廣，在作物病害的生物防治中研究非常廣泛。朱海云[25]等從銀杏中分離出一株蠟樣芽孢桿菌獼猴桃潰瘍病的防治效率為93.6%；孫一凡[26]等篩選出兩株芽孢桿菌既可增強植物抗病性，又有良好的促生能力。皮爾瑞俄類芽孢桿菌是用于農業生產的微生物新菌種，研究表明其可產生多種抑菌活性物質，如水解酶類、多肽類抗生素等物質[27]。有關皮爾瑞俄類芽胞桿菌防治植物病害已有報道，如陳雅寒[28]報道的一株皮爾瑞俄類芽胞桿菌既可以有效的防治番茄早疫病，還能明顯提高番茄產量。

研究表明，生防菌代謝過程中分泌的細胞壁降解酶，可以破壞真菌細胞壁的結構并且溶解菌體，從而抑制真菌的生長[29]。劉洋等[30]分離出的一株芽孢桿菌通過分泌蛋白酶和纖維素酶降解真菌細胞壁中蛋白質和纖維素，破壞病原菌菌絲從而抑制病原菌的生長。鐵載體是重要的生防因子，可以通過和病原菌競爭鐵元素抑制病原菌的生長[31]，陳偉[32]研究發現病原菌的生長與鐵載體濃度有關，鐵載體濃度越高對病原菌的抑制效果越明顯，鐵載體產生菌還可促進種子萌發和幼苗生長[33]，說明鐵載體在植物生長和病害防治方面都發揮著重要作用。本研究篩選的4株生防菌對病原菌都有較強的抑制作用，推測其原因，可能是通過競爭作用和溶菌作用抑制病原菌的生長，菌株分泌的酶類物質可破壞病原菌的結構，降解真菌菌絲并導致病原菌的死亡，分泌的鐵載體通過和病原菌競爭鐵元素，使得病原菌可利用的Fe3+大量減少,從而抑制病原菌生長，菌株合成的鐵載體除了給自身和植物提供可利用的鐵元素外，還可促進植物對鋅和磷等元素的吸收從而促進植物的生長[34]，說明分泌鐵載體的生防菌株除了對病原菌具有抑制作用外，還有植物生長促進作用。本實驗結果表明菌株LSH11分泌鐵載體能力最強，前期研究發現菌株LSH11具有良好的促生特性，其制成的復合菌劑可明顯的提高西葫蘆的產量，推測其他幾株菌也具有良好的促生潛力。后續將展開實驗研究幾株菌的促生特性并探究其促生作用機制。

脂肽類物質是主要的抗菌物質之一，相較于其他抑菌物質，其理化性質更穩定、抑菌范圍更廣，對細菌和真菌病原體都可有效的防治[35]。周瑚[36]等從水稻中分離出一株芽孢桿菌，其脂肽類粗提物對真菌的抑制率為14.34%±1.08%,本研究篩選出的4株菌的脂肽類粗提物對三種真菌的抑菌率為12.08%～63.92%，其中菌株R1、LSH11、TZF-1抑菌效果更明顯，抑菌率達到40%以上，表明脂肽類物質在抑制真菌的生長中發揮著重要作用，同時脂肽類物質對病原菌的抑制作用具有廣譜性。菌株CCM的脂肽類物質抑菌能力較差，但其分泌的鐵載體和胞外酶活性都較高，推測菌株CCM是通過其他機生防機制抑制病原菌的生長。本研究篩選獲得的4株菌均可分泌與生防相關的代謝產物，如鐵載體，溶菌酶，脂肽類等物質，有較好的抑菌作用，有望為燕麥根腐病的生物防治提供菌種資源。

4 結論

篩選出11株抑菌效果良好的拮抗細菌，結合生防特性進行復篩，篩選出4株綜合性能良好的菌株，經鑒定分別是枯草芽孢桿菌，貝萊斯芽孢桿菌，萎縮芽孢桿菌和皮爾瑞俄類芽孢桿菌。4株菌均可分泌鐵載體、溶菌酶和脂肽等與生防有關的物質，具有良好的生防潛力。