瑞香狼毒根提取物對蕎麥桃蚜的毒力及其作用機制

高玉蓮，王貽卉，常 靜，康 鵬，馬崇勇，韓志勇, 李海平*

(1. 內蒙古農業大學園藝與植物保護學院，內蒙古 呼和浩特 010019； 2. 內蒙古自治區草原工作站，內蒙古 呼和浩特 010020；3. 內蒙古自治區烏拉特前旗林業和草原局草原工作站，內蒙古 烏拉特前旗 014400)

瑞香狼毒(StellerachamaejasmeL.)屬于瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒屬(Stellera)，民間又稱紅狼毒、饅頭花、斷腸草等，是一種多年生草本植物[1]。瑞香狼毒因其強競爭性而成為優勢種，在草原上擴散蔓延，是影響草原退化的主要植物種群之一[2]。該植物全株有毒，以根的毒性最大，據《中國土農藥志》記載，我國民間常將其根粉用于害蟲防治[3]。近些年的研究表明，瑞香狼毒對菜粉蝶(Pierisrapae)、蚜蟲、螨等多種害蟲都具有較強的殺蟲活性[4]。

蕎麥(FagopyrumesculentumMoench)起源于中國，栽培歷史悠久，是全世界重要的雜糧作物之一，主要種植于中國、俄羅斯、日本、波蘭等國。蕎麥具有抗旱、耐瘠、適應性強、生育期短等特點，是我國生態脆弱地區重要的糧食、飼草飼料及救荒作物[5]。蕎麥全身是寶，其中苦蕎具有降血脂、降血糖、降尿糖、療胃疾和改善便秘的營養保健功能，其預防和治療高血壓的功能是其他作物不可比擬的，因此被認為是21世紀人類重要的健康食物資源[6-8]。

蕎麥抗逆性很強，病蟲草害較其它作物相對較少、較輕。近年來隨著人們生活水平的提高和對蕎麥保健功能的進一步認知，蕎麥種植面積不斷擴大，部分地區連年耕作，規模化生產，病蟲害也有逐漸加重的趨勢[8]。蕎麥上的害蟲主要有螨(二斑葉螨Tetranychusurticae、截形葉螨Tetranychustruncatus)，蚜蟲(桃蚜Myzuspersicae、棉蚜Aphisgossypii)，花薊馬(Frankliniellaintonsa)，西伯利亞龜象(Rhinoncussibiricus)以及草地螟(Loxostegesticticalis)等[9-10]。其中蚜蟲和花薊馬是蕎麥花期的主要害蟲，而蕎麥花期占蕎麥整個生長期的2/3左右，對蕎麥產量影響很大[11-12]。近年內蒙古地區蕎麥上蚜蟲災害發生較重，其中桃蚜危害最重。為保證蕎麥的產量，同時兼顧蕎麥的綠色保健功能，對蚜蟲進行綠色有效防控是非常重要的。因此，本論文研究了瑞香狼毒根提取物對蕎麥桃蚜的毒力及其作用機制，為未來利用瑞香狼毒防治蕎麥桃蚜提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

瑞香狼毒根于2018年8月采自內蒙古烏蘭察布四子王旗草原，將采集到的瑞香狼毒根清洗干凈并充分陰干，用粉碎機粉碎，置于陰涼干燥處保存備用。

供試蚜蟲為實驗室蕎麥上飼養的桃蚜。

1.2 試驗方法

1.2.1瑞香狼毒根石油醚提取物的制備 采用常溫浸泡法，用小型粉碎機(永康紅太陽機電有限公司，浙江)將陰干的瑞香狼毒根粉末過40目篩，按照料液比為1∶8(g∶mL)加入石油醚，浸泡72 h后過濾，將提取液置旋轉蒸發儀(上海比朗儀器有限公司，上海)上進行旋轉蒸發，蒸掉大部分石油醚后，將剩余提取物取出自然揮干至膏狀，保存在4℃冰箱備用。

1.2.2瑞香狼毒根石油醚提取物對桃蚜的毒力測定 將提取物溶解于少量95%乙醇并用水溶液稀釋成5個不同的濃度(500，1 000，2 000，4 000，8 000 mg·L-1)，以不加提取物的相應溶液為對照。參考張炳宗[13]的方法，用浸蟲浸葉法測定毒力。采集蟲口密度大的蕎麥葉，仔細挑選健康的無翅成蚜(50頭左右)留在葉面上，將帶蟲的蕎麥葉浸入待測溶液6～7 s后取出，瀝干，置于鋪有濾紙的培養皿(直徑9 cm)中，放置于(25±1)℃的光照培養箱內飼養，每一濃度重復3次，24 h后記錄死亡情況。以解剖針輕觸蟲體無任何反應記為死亡，計算死亡率和校正死亡率。用POLO Plus軟件計算致死中濃度LC50值及95%置信區間。

1.2.3瑞香狼毒根石油醚提取物處理桃蚜后其體內靶標酶活性的測定 乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是昆蟲體內重要的神經傳遞物質乙酰膽堿的裂解酶，也是很多殺蟲劑的重要靶標酶。采用高希武[14]的方法對乙酰膽堿酯酶(AChE)活性進行測定。

腺苷三磷酸酶(Adenosine triphosphatase，ATPase)是一類膜結合酶，該酶系參與釋放能量供細胞使用的同時，還參與細胞基本代謝和生理活動，特別是對于維持細胞膜內外離子濃度梯度有著非常重要的作用，被認為細胞毒性的敏感指標。腺苷三磷酸酶活性測定按照ATPase測試盒說明進行。

1.2.4瑞香狼毒根石油醚提取物處理后桃蚜解毒酶活性的測定 昆蟲在受到外界各種有毒物質的傷害時，解毒酶系會發揮其解毒作用。谷胱甘肽-S-轉移酶(Glutathione-S-transferase，GSTs)、細胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)和羧酸酯酶(Carboxylesterase，CarE)被認為是昆蟲體內的主要解毒酶。谷胱甘肽-S-轉移酶活性測定參照Habig等方法[15]；細胞色素P450活性的測定參照Brogdon等和Tiwari等的方法[16-17]；羧酸酯酶活性測定參照Van Aspern的方法測定并略有改動[18]。

1.2.5酶源蛋白含量測定 為計算靶標酶和解毒酶的活性，需要測定酶原蛋白質含量。采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白含量[19]。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010軟件對數據進行處理和繪圖，采用SPSS 20.0統計分析軟件對數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和差異顯著性檢驗(LSD)，其顯著水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 瑞香狼毒根石油醚提取物對桃蚜的毒殺活性

由表1可知，隨著瑞香狼毒根石油醚提取物濃度增大，桃蚜的死亡率和校正死亡率逐漸增加。24 h瑞香狼毒根石油醚提取物對桃蚜致死中濃度為1 243.7 mg·L-1。

表1 瑞香狼毒根石油醚提取物對桃蚜的毒力Table 1 Toxicity of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root to Myzus persicae

2.2 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對桃蚜體內靶標酶活性的影響

2.2.1對乙酰膽堿酯酶(AChE)的影響 如圖1所示，桃蚜經瑞香狼毒根石油醚提取物處理24 h后，其體內的AChE活性與對照相比均顯著降低(P<0.05)，抑制程度與處理濃度沒有直接的相關性。濃度為1 000 mg·L-1時，AChE活性最低，與對照相比降低了21.7%。

圖1 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對桃蚜乙酰膽堿酯酶活性的影響Fig.1 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on AChE activity of Myzus persicae注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同Note:Different letters mean significant difference at the 0.05 level. The same as below

2.2.2對腺苷三磷酸酶(ATPase)的影響 圖2顯示瑞香狼毒根石油醚提取物處理對桃蚜ATPase活性的影響。如圖所示，隨瑞香狼毒根石油醚提取物濃度的增大，桃蚜體內Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性上升，在濃度為4 000 mg·L-1時達到最大值，分別為0.01和0.006 2 μmolPi·mg-1·h-1，其活性分別是對照的12.0，1.8倍，顯著高于對照(P<0.05)。之后隨著提取物濃度的增加活性下降，但仍顯著高于對照。

圖2 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對桃蚜ATPase活性的影響Fig.2 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on ATPase activity of Myzus persicae

2.3 瑞香狼毒根石油醚提取物對桃蚜解毒酶活性的影響

2.3.1對谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)的影響 如圖3所示，瑞香狼毒根石油醚提取物處理桃蚜后，對桃蚜體內GSTs活性有明顯的誘導作用，不同濃度與對照相比均有顯著增加。在濃度為500 mg·L-1時，GSTs的活性最高，為2.4 mOD·mg Pro-1·min-1，是對照的1.4倍。

圖3 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對桃蚜谷胱甘肽-S-轉移酶活性的影響Fig.3 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on GSTs activity of Myzus persicae

2.3.2對細胞色素P450的影響 圖4是瑞香狼毒根石油醚提取物處理對桃蚜細胞色素P450活性的影響。隨著瑞香狼毒根石油醚提取物濃度的增大，細胞色素P450活性逐漸增大，不同濃度與對照相比均有顯著增加(P<0.05)。在濃度為8 000 mg·L-1時，細胞色素P450活性最大，是對照的1.3倍。

圖4 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對桃蚜細胞色素P450活性的影響Fig.4 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on cytochrome P450 activity of Myzus persicae

2.3.3對羧酸酯酶(CarE)的影響 在瑞香狼毒根石油醚提取物的影響下，桃蚜體內羧酸酯酶活性下降，除最大濃度8 000 mg·L-1外，CarE活性與對照均有顯著差異(P<0.05)(圖5)。

3 討論與結論

近年來，隨著人們生活水平和對食品安全要求的提高，病蟲害的綠色防控技術越來越受到重視，綠色農藥的概念被提出并在實踐中不斷發展應用。植物源農藥是直接利用具有生物活性的植物或提取其有效成分制成的，已成為病蟲害綠色防控技術中綠色農藥的重要組成部分[20]。

圖5 瑞香狼毒根石油醚提取物處理對桃蚜羧酸酯酶活性的影響Fig.5 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on the CarE activity of Myzus persicae

很早以前人們就發現瑞香狼毒的殺蟲作用，并在生產中加以應用。隨著科技的進步，瑞香狼毒的殺蟲作用進一步得到研究證實。陳梅等[21]研究發現瑞香狼毒根石油醚提取物對朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)有很好的觸殺活性，當瑞香狼毒根石油醚提取物濃度為2 mg·mL-1時，朱砂葉螨的校正死亡率為83.9%。陳瓊等[22]的研究表明，瑞香狼毒Ⅰ段粗分物對東亞飛蝗(Locustamigratoria)具有較強的毒殺作用，在粗分物濃度為10 mg·mL-1，72 h時對東亞飛蝗的校正死亡率為92.5%。進一步研究發現，瑞香狼毒不同溶劑提取物殺蟲程度不同。熊納納等[23]研究了狼毒石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及水等4種不同溶劑提取物的殺煙蚜活性，其中，石油醚提取物的殺煙蚜活性最好，在濃度為0.5 mg·mL-1，12 h時蚜蟲全部死亡。本試驗采用瑞香狼毒根石油醚提取物對蕎麥上的桃蚜進行毒力測定，其LC50為1 243.7 mg·L-1。相對于他人研究結果，本試驗對昆蟲的致死中濃度較大。高漫璐等[24]研究瑞香狼毒根石油醚提取物對東亞飛蝗毒力，結果顯示對東亞飛蝗有拒食、胃毒、觸殺等作用，其中拒食作用較大，而48 h的觸殺和胃毒作用分別為2 599.9，11 770 mg·mL-1。這些研究結果說明，瑞香狼毒根石油醚提取物可能含有多種殺蟲成分，對不同昆蟲的殺滅成分及效果不同，必須分離其主要殺蟲成分，才能進一步開發作為殺蟲劑使用。

眾多研究表明，大量的天然產物和植物提取物具有抑制昆蟲AChE活性的作用。匡傳富等[25]研究發現，八角茴香(Illiciumverum)提取物抑制了桃蚜的AChE活性，梁為等[26]研究發現瑞香狼毒超臨界CO2萃取物對朱砂葉螨AChE有較好的抑制作用，抑制率最高達50.1%。本試驗研究結果表明，用瑞香狼毒石油醚提取物處理桃蚜后，桃蚜體內AChE的活性降低，與陳義娟[27]研究香樟(Cinnamomumcamphora)葉提取物中殺螨活性物質的作用機理結果相似；但和有機化學殺蟲劑如有機磷、氨基甲酸酯類殺蟲劑對AChE的絕對抑制作用不同，對AChE的抑制率較低。本結果表明瑞香狼毒根石油醚提取物處理桃蚜后，對桃蚜體內AChE活性有一定的抑制。

ATPase是菊酯類殺蟲劑的主要作用靶標之一[28]。張叢等[29]研究發現4種菊酯類殺蟲劑對枸杞蚜蟲2種ATPase活性均有抑制作用，Li等[30]研究發現，3種除蟲菊酯類殺蟲劑對擬水狼蛛(Piratasubpiraticus)和二化螟(Chilosuppressalis)體內Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均表現出抑制作用，但抑制率最高均不超過50%。梁為等[26,31]研究瑞香狼毒對朱砂葉螨的毒理機制，瑞香狼毒超臨界CO2萃取物和天然化合物東莨菪素都能夠顯著抑制朱砂葉螨Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性，其中瑞香狼毒超臨界CO2萃取物對兩者的抑制率高達44.5%和67.1%。本文研究表明，用瑞香狼毒根石油醚提取物處理桃蚜后，對桃蚜體內的Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均表現為誘導作用。由此推測，ATPase可能不是瑞香狼毒對桃蚜作用的靶標酶，但還需要進一步研究證實。

殺蟲劑一方面作用于昆蟲的靶標系統，殺死昆蟲；另一方面，昆蟲也會對這些有毒物質進行代謝，降低殺蟲劑對昆蟲的作用。谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)、細胞色素P450酶和羧酸酯酶(CarE)是昆蟲體內3種重要的解毒酶，在昆蟲對外源有毒物質的解毒代謝中發揮重要作用。陳德霞等[32]研究發現，亞洲小車蝗(Oedaleusasiaticus)取食次生代謝物質如黃酮、單寧、生物堿等含量低的牧草，體內解毒酶活性也低，反之亦然。有研究表明4種植物源化合物處理亞洲小車蝗后，亞洲小車蝗體內GSTs,CYP450和CarE活性較對照均明顯增加[33]；棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)取食棉酚含量高的寄主植物后，CYP450活性顯著升高[34]。現有的研究已經發現，瑞香狼毒體內含有多種植物次生代謝物質，如：黃酮類、萜類、香豆素類等。本試驗中，瑞香狼毒根石油醚提取物不同濃度處理桃蚜后，桃蚜體內GSTs和細胞色素P450活性均顯著高于對照，且桃蚜體內細胞色素P450活性與瑞香狼毒根石油醚提取物的濃度呈顯著正相關關系。說明瑞香狼毒根石油醚提取物進入桃蚜體內，誘導桃蚜體內解毒酶特別是細胞色素P450和GSTs的活性增加，增強對瑞香狼毒提取物的代謝，從而降低了瑞香狼毒對桃蚜的毒性。

奚廣生和李海濤[35]研究表明，人參(Panaxginseng)莖葉、根部皂苷對桃蚜體內的CarE有明顯的抑制作用；吳德東等[36]研究北烏頭(Aconitumkusnezoffii)乙酸乙酯萃取物亞致死劑量對舞毒蛾(Lymantriadispar)幼蟲的影響，舞毒蛾幼蟲CarE活性受到抑制，抑制程度隨處理時間延長逐漸加強。本文研究結果表明，瑞香狼毒根石油醚提取物抑制了桃蚜體內的CarE活性。曹威[37]研究發現瑞香狼毒素對棉蚜CarE活性有一定的抑制作用，但不明顯，與本文研究結果相似。CarE活性受到抑制后，其解毒能力降低，可延長外源毒物在體內的存留時間，并發揮其毒效而致昆蟲中毒死亡，因此CarE活性受到抑制可能是瑞香狼毒提取物導致桃蚜死亡的原因之一。但在瑞香狼毒提取物濃度為8 000 mg·L-1時，桃蚜CarE活性的變化與其它濃度不同，活性和對照沒有顯著差異。從瑞香狼毒根石油醚提取物對桃蚜的毒力結果看，當提取物濃度為8 000 mg·L-1時桃蚜的死亡率為97.5%，在死亡率如此高的情況下存活的桃蚜可能有抗性基因或某些基因發生突變。植物源化合物是否和其他有毒化合物一樣影響昆蟲的基因表達或改變昆蟲信號轉導，還需要通過研究提取物對桃蚜CarE的體外抑制和基因表達，才能進一步了解。

植物源殺蟲劑由于其體內次生代謝物質種類繁多、性質多樣，對不同昆蟲的作用程度和機理也不盡相同。同時害蟲對外源性有害物質侵入的反應機制也是多樣的，昆蟲通過各種生物功能的酶系及解毒、代謝系統相互交織聯系、補充而起到解毒作用[38]。瑞香狼毒對多種昆蟲具有毒殺作用，但可能對每種昆蟲的主要殺蟲成份不同，因而殺蟲機理也各不相同。未來應進一步明確瑞香狼毒對桃蚜的主要殺蟲成份，在此基礎上才能研究其殺蟲機理，為未來開發瑞香狼毒作為殺蟲劑防治蕎麥桃蚜提供更好的科學依據。