“抗”“感”苜蓿品種對豌豆蚜適應(yīng)性及體內(nèi)酶活的影響

魏江文，劉 磊，王森山, 陳麗霞，蔣明君，王庚浩，徐亨昊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)屬于豆科苜蓿屬，是一種多年生草本植物。由于其種植歷史悠久、營養(yǎng)價值極高、易消化，被稱為“牧草之王”，在歐亞大陸和世界各國廣泛種植[1]。紫花苜蓿近年來被大量種植，已被選育出多個品種，‘甘農(nóng)5號’為紫花苜蓿抗豌豆蚜高抗品種，作為我國第一個抗蟲(高抗蚜蟲、兼抗薊馬)的苜蓿品種，其在多地表現(xiàn)出適應(yīng)性強、生產(chǎn)性能高、產(chǎn)草量高、品質(zhì)好的特點，具有潛在的推廣價值，適宜于在甘肅灌區(qū)大面積推廣應(yīng)用[2-3]。‘獵人河’為紫花苜蓿感蟲品種，它的突出優(yōu)點是再生快、葉量大、產(chǎn)草量高，比一般紫花苜蓿增產(chǎn)15%～60%[4-6]。但是，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和苜蓿種植面積的擴大，苜蓿病蟲害的問題也越來越多。

危害苜蓿的蚜蟲主要是苜蓿蚜(Aphiscraccivora)、豌豆蚜(豆無網(wǎng)長管蚜，Acyrthosiphonpisum)和苜蓿斑蚜(Therioaphismaculata)[2,7]。豌豆蚜有苜蓿型豌豆蚜和豌豆型豌豆蚜，近年來豌豆蚜已經(jīng)成為危害苜蓿的主要害蟲。甘肅種植苜蓿的面積占我國苜蓿種植總面積的70%，豌豆蚜的為害面積近100%，而且豌豆蚜作為生態(tài)學(xué)研究的模式昆蟲，具有復(fù)雜的生活周期、多樣的生殖方式、發(fā)育歷期短、世代重疊嚴重、極易適應(yīng)環(huán)境等特點[7]，因此，研究“抗”“感”兩苜蓿品種對豌豆蚜的影響，結(jié)合生理及生化兩方面去研究豌豆蚜，培育優(yōu)良的抗蚜苜蓿品種是防治豌豆蚜理想的手段。

昆蟲在維持正常的生理生化代謝過程中，保護酶和解毒酶發(fā)揮著重要作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)共同構(gòu)成昆蟲體內(nèi)保護酶系，這3者能互相協(xié)調(diào)一致，避免超氧陰離子或其他活性氧自由基對細胞膜的防御系統(tǒng)造成傷害，能維持昆蟲體內(nèi)自由基平衡。已有研究報道昆蟲在受到外界刺激或不利的條件下體內(nèi)保護酶的活性如果受到抑制會對蟲體造成毒害作用，進而抑制昆蟲的生長發(fā)育，但如果蟲體內(nèi)保護酶活性升高則會促進昆蟲的生長發(fā)育[8-10]。細胞色素P450s(Cytochrome P450s，P450s)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase，GST)和羧酸酯酶(Carboxylesterase，CarE)等解毒酶在分解代謝農(nóng)藥、植物次生物質(zhì)等外源毒素和維持昆蟲正常生理生化活動等方面起到至關(guān)作用[9-13]。丁杰[14]將灰飛虱接到五種寄主植物后測定了CarE，GST和多功能氧化酶(Multifunction oxidases，MFO)三種解毒酶的變化趨勢，結(jié)果表明在72 h之內(nèi)，體內(nèi)的羧酸酯酶和多功能氧化酶活性變化整體呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，GST的活性變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。郅軍銳等[15]發(fā)現(xiàn)二斑葉螨取食西花薊馬為害的菜豆(PhaseolusvulgarisL．)能誘導(dǎo)二斑葉螨(Tetranychusurticae)和西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)成蟲體內(nèi)的保護酶和解毒酶活性，5 h時變化趨勢相同，但在5 h之后和不同蟲態(tài)下酶活性的變化趨勢不同，說明這2種昆蟲對同一寄主植物生理適應(yīng)性不完全相同。楊玉婷[16]選取4種寄主植物[韭菜(AlliumtuberosumRottlerexSprengel)、生菜(Lactucasativavar.romana)、大蔥(Alliumfistulosumvar.gigante-umMakino)和馬鈴薯(olanumtuberosumLinn.)]飼養(yǎng)韭蛆，并分別測定不同寄主飼養(yǎng)后韭蛆的三大保護酶系，研究發(fā)現(xiàn)取食大蔥的幼蟲POD活性最高，取食韭菜的幼蟲CAT活性最高，顯著高于取食其他寄主，表明在韭菜遲眼蕈蚊的生長發(fā)育與寄主植物有一定的關(guān)聯(lián)，寄主植物不同，韭蛆體內(nèi)保護酶系的活性也不盡相同。

基于以上研究分析，“抗”“感”兩個苜蓿品種可能會影響豌豆蚜生長發(fā)育及豌豆蚜的生理生化指標(biāo)。為了明確不同苜蓿品種對豌豆蚜存活率及對豌豆蚜體內(nèi)酶活的影響，本研究以蠶豆(ViciafabaL.)葉片上擴繁的綠色型豌豆蚜和“抗”“感”2個苜蓿品種為供試材料，通過測定豌豆蚜在不同時間3種保護酶(SOD，POD和CAT)和3種解毒酶(P450s，GST和CarE)活性的變化，探討“抗”“感”兩個苜蓿品種對豌豆蚜的適應(yīng)性，以期為科學(xué)防治豌豆蚜，培育優(yōu)良的抗蚜苜蓿品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物材料：紫花苜蓿播種于育苗杯(土壤∶草炭∶蛭石=3∶2∶1)中育苗(育苗杯直徑10 cm，高14 cm，育苗50杯，每杯保苗3株)；在人工氣候箱中進行(溫度：25℃，相對濕度：70%，光照：16 h/8 h)育苗，挑選生長發(fā)育一致的40 d齡的苜蓿植株進行試驗。

供試蟲源：綠色豌豆型豌豆蚜(蟲源為單頭豌豆蚜在室內(nèi)盆栽蠶豆上擴繁)，飼養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)箱(溫度：25℃，濕度：70%，光照：16 h/8 h)。挑選成蟲在離體葉片飼養(yǎng)(同等飼養(yǎng)條件)，待產(chǎn)蚜后剔除成蚜，選取3 d齡若蚜用于試驗。

1.2 研究方法

1.2.12個苜蓿品種對豌豆蚜存活的影響 試驗設(shè)置CK，LF和GF共3組。CK代表接蟲到蠶豆上的豌豆蚜；LF代表接蟲到‘獵人河’感蟲苜蓿品種上的豌豆蚜；GF代表接蟲到‘甘農(nóng)5號’抗蟲苜蓿品種上的豌豆蚜。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接100頭蚜蟲。將離體葉片上飼養(yǎng)的3 d齡的豌豆蚜分別接種到蠶豆、“抗”“感”2個苜蓿品種上。24 h后統(tǒng)計并計算其有翅蚜率，分別于0 h，12 h，24 h，36 h，48 h，60 h和72 h(0 h為CK)計算其存活率。

1.2.22個苜蓿品種對豌豆蚜保護酶活性的分析 接種處理及樣品收集：試驗設(shè)置同1.2.1，每處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)接160頭豌豆蚜，處理0 h，12 h，24 h，48 h和60 h(0 h為CK)后取樣，共收集45個樣品。每個樣品取樣10頭。挑取的豌豆蚜經(jīng)液氮處理10 min后保存于—80℃冰箱以備酶活性測定。

2個苜蓿品種對豌豆蚜保護酶活性分析：SOD，POD和CAT活性測定參考袁偉寧等的測定方法[17]。

1.2.32個苜蓿品種對豌豆蚜解毒酶活性的分析 CarE活性測定：羧酸酯酶的活性測定參照王常清等的測定方法[18]。

GST活性測定：GST活性測定參照王常清[18]等文獻的方法并略有改進，接種處理及樣品收集同1.2.2。

酶原液制備方法如下：將—80℃冰箱中取出的樣品置于1.5 mL離心管中加入600 μL 66 mmol·L-1(pH=7.0)的磷酸緩沖液中，在冰上勻漿，在4℃，8 000 g下離心10 min，吸取上清液用于后續(xù)測定。

酶標(biāo)板提前預(yù)熱30 min，300 μL的反應(yīng)體系：將240 μL 66 mmol·L-1(pH=7.0)的磷酸緩沖液，30 μL 50 mmol·L-1GSH，10 μL 30 mmol·L-1的2，4-二硝基氯苯和20 μL酶液按先后順序加入96孔板，在37℃下保溫反應(yīng)20 min。用30 mmol·L-12，4-二硝基氯苯作底物，經(jīng)GSTs作用，與還原型谷胱甘肽反應(yīng)生成硫醇尿酸衍生物，在340 nm處測OD值，記錄10 s和310 s吸光度為A1和A2。將不添加酶液的緩沖液代替酶原液作為陰性對照。

計算公式：GST比活力(mol·min-1·g-1)=[(A2—A1)/(ε×d×V反總×106)]/(W×V樣/V樣總)/T=0.536×(A2—A1)/W

V反總：反應(yīng)體系總體；W：樣本質(zhì)量；ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×103L·mol-1·cm-1；d：96孔板光徑，0.5 cm；V樣：樣本體系；V樣總：樣本總體系。

細胞色素P450 s酶活性測定：參照王康[19]的方法，略有改進，接種處理及樣品收集同1.2.2。

酶原液制備方法如下：將—80℃冰箱中取出的樣品置于1.5 mL離心管中加入200 μL預(yù)冷的0.1 mol·L-1(pH 7.5)的磷酸緩沖液(含1.0×10-3mol·L-1EDTA)冰上研磨充分后再加入800 μL緩沖液，在4℃，15 000 g條件下離心10 min，吸取上清液為酶液，用于后續(xù)測定實驗。

酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，把波長調(diào)到405 nm，用磷酸緩沖液把對硝基苯甲醚稀釋到2 mmol·L-1(現(xiàn)配現(xiàn)用)；在96孔酶標(biāo)板中分別加入2 mmol·L-1的對硝基苯甲醚180 μL和10 μL酶液以及10 μL 9.6 mmol·L-1的還原型輔酶Ⅱ后啟動反應(yīng)。30℃水浴中反應(yīng)2 h，在酶標(biāo)儀中測定405 nm下的吸光值。用不添加還原型輔酶Ⅱ的緩沖液代替酶源液來做陰性對照。測定結(jié)束之后，根據(jù)對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線、蛋白含量、所測OD值計算細胞色素P450 s酶比活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016統(tǒng)計處理試驗數(shù)據(jù)，整理后的數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用單因素方差分析來顯著性檢驗，用Duncan’s新復(fù)極差法進行多重比較，全部數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，以P<0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，作圖軟件使用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個苜蓿品種對豌豆蚜存活的影響

豌豆蚜取食不同苜蓿品種后存活率結(jié)果見表1。“抗”“感”苜蓿品種對豌豆蚜的存活有顯著影響(P<0.05)。LF，GF的存活率隨著時間均顯著降低，GF的存活率降低更明顯。接蟲6 h，CK和LF，GF之間存活率差異不顯著；但接蟲12 h之后，CK，LF，GF三者之間存活率差異顯著(P<0.05)。接蟲24 h時，GF的存活率顯著低于CK和LF處理(P<0.05)，為46.7%；在72 h，GF的存活率最低，為6.7%。24 h時，GF的有翅蚜率最高，為14.3%。CK，LF，GF三者之間的有翅蚜率差異顯著(P<0.05)。

表1 2個苜蓿品種對豌豆蚜存活的影響Table 1 Effects of two alfalfa varieties on the growth and development of pea aphid

2.2 2個苜蓿品種對豌豆蚜保護酶活性的影響

豌豆蚜取食“抗”“感”2個苜蓿品種后其保護酶活性測定結(jié)果見下圖。

由圖1可知，除24 h的POD活性被抑制之外，其他處理時間豌豆蚜POD活性均增加，12 h，48 h和60 h的LF與GF處理的POD活性均高于CK。隨著取食苜蓿后時間的延長，豌豆蚜LF和GF的POD活性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。24 h時，CK的POD活性最高。在48 h時，CK，LF，GF三者間的POD活性差異顯著(P<0.05)。

圖1 2個苜蓿品種對豌豆蚜POD活性的影響Fig.1 Effects of two alfalfa varieties on POD activity of pea aphid注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different letters indicate significant differences at the 0.05 level,the same as below

由圖2可知，隨著取食苜蓿后時間的延長，CK，LF和GF的SOD活性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。豌豆蚜取食不同品種苜蓿后，在12 h時，LF的SOD活性顯著高于CK與GF處理(P<0.05)；在24 h時，CK，LF，GF的SOD活性差異顯著(P<0.05)，GF的SOD活性最高；取食48 h后，LF的SOD活性被抑制；到60 h時，LF和GF的SOD活性均被抑制。

由圖3可知，LF的CAT活性在不同時間段呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，GF的CAT活性呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。LF的CAT活性在12 h明顯被抑制。24 h和60 h時，CK，LF，GF三者CAT活性差異顯著(P<0.05)。在取食后48 h，GF的CAT活性顯著高于CK和LF(P<0.05)。

圖3 2個苜蓿品種對豌豆蚜CAT活性的影響Fig.3 Effects of two alfalfa varieties on CAT activity of pea aphid

2.3 2個苜蓿品種對豌豆蚜解毒酶活性的影響

豌豆蚜取食“抗”“感”2個苜蓿品種后其解毒酶活性測定結(jié)果見下圖。

由圖4可知，CK和LF的CarE活性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。豌豆蚜取食不同苜蓿品種后，除48 h GF的CarE活性被抑制，其余時間的CarE活性均增加。在12 h和60 h時，CK，LF和GF的CarE活性差異顯著(P<0.05)；取食24 h，LF和GF的CarE活性顯著高于CK(P<0.05)；在48 h，LF的CarE活性與CK和GF處理差異顯著(P<0.05)。

圖4 2個苜蓿品種對豌豆蚜CarE活性的影響Fig.4 Effects of two alfalfa varieties on CarE activity of pea aphid

由圖5可知，LF的GSTs活性在48 h內(nèi)基本保持不變，在60 h有上升的趨勢，GF的GSTs活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在12 h，24 h和48 h時，GF的GSTs活性顯著高于CK(P<0.05)。60 h時，CK，LF和GF三者間的GSTs活性差異顯著(P<0.05)。

圖5 2個苜蓿品種對豌豆蚜GSTs活性的影響Fig.5 Effects of two alfalfa varieties on GSTs activity of pea aphid

由圖6可知，GF的P450s活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。CK，LF的P450s活性在不同時間段趨勢不明顯。GF的P450s活性在12 h，24 h和48 h時顯著高于CK(P<0.05)。在60 h，CK，LF和GF三者間P450活性差異不顯著。

圖6 2個苜蓿品種對豌豆蚜P450s活性的影響Fig.6 Effects of two alfalfa varieties on P450s activity of pea aphid

3 討論

在進行不同苜蓿品種對豌豆蚜存活影響試驗時發(fā)現(xiàn)，豌豆型豌豆蚜不能盡快適應(yīng)紫花苜蓿，可能是由于豌豆型豌豆蚜體內(nèi)缺乏相應(yīng)的效應(yīng)因子或體內(nèi)消化酶和解毒酶調(diào)控力度不夠，也可能與2種苜蓿受到豌豆蚜刺激產(chǎn)生的次生物質(zhì)相關(guān)[20-22]。原二亮[20]認為，染料木黃酮能夠刺激豌豆蚜取食，使其大量攝入植物次生物質(zhì)，從而降低其存活率。Sanchez-Arcos等[21-22]使用了基于質(zhì)譜的非目標(biāo)代謝組學(xué)方法來鑒定在不同寄主植物中不同的化合物，研究結(jié)果表明寄主轉(zhuǎn)換可能會產(chǎn)生黃酮類、皂苷類、非蛋白源性氨基酸和肽類等化合物，從而影響豌豆蚜存活率。有翅蚜的形成是由環(huán)境條件和豌豆蚜自身基因型共同決定的，溫度、光周期以及種群密度和天敵是誘導(dǎo)翅型分化的主要原因[23-24]，表1結(jié)果表明，有翅蚜的多少可能還與不同的寄主有關(guān)。本文以紫花苜蓿2個苜蓿品種為寄主，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿抗蟲品種‘甘農(nóng)5號’能使豌豆蚜存活率從100%降到6.7%(在72 h)，而感蟲品種‘獵人河’使豌豆蚜存活率從100%降到66.0%(在72 h)，表明抗蟲苜蓿品種體內(nèi)含有某種次生物質(zhì)，能使豌豆蚜存活率顯著下降[20-22]。后期基于代謝組學(xué)的方法鑒定豌豆蚜取食過的2個苜蓿品種體內(nèi)的次生物質(zhì)，可能會找到豌豆蚜存活率低的原因。

當(dāng)昆蟲在搜尋到新的寄主進食的時候，植物由于受到刺激產(chǎn)生的次生物質(zhì)會連同植物組織一同進入蟲體，次生物質(zhì)會對昆蟲的機體產(chǎn)生脅迫作用，破壞昆蟲細胞內(nèi)的自由基產(chǎn)生與清除系統(tǒng)，導(dǎo)致昆蟲體內(nèi)有毒物質(zhì)積累，從而對昆蟲產(chǎn)生毒害作用[25]。昆蟲可以通過改變體內(nèi)酶活性來適應(yīng)寄主的變化，不同酶對于新寄主環(huán)境的反應(yīng)速度也不同[26-28]。從本試驗的結(jié)果可以看出，取食2個苜蓿品種的豌豆蚜，體內(nèi)保護酶和解毒酶的活性也被不同程度的誘導(dǎo)或抑制，取食抗蟲品種的豌豆蚜酶活性總體上高于取食感蟲品種的豌豆蚜酶活性。尤其在豌豆蚜取食24 h時最明顯，取食2個苜蓿品種的豌豆蚜體內(nèi)POD活性均被抑制，SOD，CarE，GSTs和P450s這4個酶都被激活，說明此時豌豆蚜不能及時將H2O2分解成H2O和O2，對豌豆蚜造成毒害作用，而此時起調(diào)控作用的是SOD，CarE，GSTs和P450s[16]。結(jié)合表1取食抗蟲苜蓿品種的豌豆蚜的存活率在24 h急劇下降，24 h之后存活率下降不明顯，24 h之后，豌豆蚜體內(nèi)的酶活性也漸趨穩(wěn)定，說明在24 h時豌豆蚜體內(nèi)的酶被最大程度的激活，調(diào)控不同苜蓿品種的次生物質(zhì)或有毒物質(zhì)對豌豆蚜所帶來的影響[20,28-30]。24 h之后其他酶活性下降，POD酶活性顯著升高，說明24 h后豌豆蚜體內(nèi)起主要調(diào)控作用的酶是POD，但結(jié)合豌豆蚜的存活率，說明這6種酶并不能代謝抗蟲苜蓿品中對豌豆蚜造成的毒害作用；而取食感蟲品種苜蓿的豌豆蚜存活率下降不明顯，POD，SOD和CarE活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，CAT活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，結(jié)合豌豆蚜的存活率說明這6種酶可能會調(diào)控感蟲苜蓿品系使豌豆蚜引起的不良反應(yīng)。在不同的時間段內(nèi)，取食兩苜蓿品種的豌豆蚜CarE活性相比CK顯著升高，表明CarE在適應(yīng)兩苜蓿品種時起到重要的調(diào)控作用。由此可以看出，豌豆蚜受到不同種類次生物質(zhì)或不同濃度同種次生物質(zhì)脅迫后，體內(nèi)保護酶和解毒酶活性的變化是一個復(fù)雜的過程，去適應(yīng)外界環(huán)境條件的變化。也有相關(guān)研究[26-27,31]表明，消化酶(脂肪酶、胃蛋白酶和α-淀粉酶)、乙酰膽堿酯酶等酶在適應(yīng)新寄主中可能發(fā)揮重要作用，后期可以進行試驗。從本試驗可以看出，2個品種的苜蓿對豌豆蚜存活和酶活的影響相對較大，而且抗蟲品種的影響大于感蟲品種的影響，進一步驗證紫花苜蓿‘甘農(nóng)5號’抗蚜性較好。后期可將取食不同品種苜蓿的豌豆蚜進行轉(zhuǎn)錄組測序，進行驗證在取食前后豌豆蚜體內(nèi)不同酶活性的變化，然后定量分析幾種酶基因表達量的變化，篩選出關(guān)鍵基因，用RNAi技術(shù)驗證關(guān)鍵基因的基因功能，進一步完善豌豆蚜對不同苜蓿品種的適應(yīng)機制。

4 結(jié)論

本試驗將豌豆蚜接種到“抗”“感”2個苜蓿品種上，通過測定豌豆蚜體內(nèi)生理酶活性和存活率來進一步比較豌豆蚜對2個苜蓿品種適應(yīng)性，結(jié)果表明感蚜紫花苜蓿品種‘獵人河’對豌豆蚜的存活率及酶活性影響相對較小，一段時間之后豌豆蚜可能會在‘獵人河’品種上定殖。抗蚜品種‘甘農(nóng)5號’對豌豆蚜的存活率及酶活性影響相對較大，不適于豌豆蚜定殖。豌豆蚜在受到有毒物質(zhì)或次生物質(zhì)脅迫時，會通過各種酶系共同維持機體內(nèi)的代謝平衡，以適應(yīng)外界環(huán)境條件的變化。