含羧甲基纖維素鈉的發酵乳中脂肪檢測技術

劉芳芳 薛敏敏 吳 倩 彭程程 鄧凌云

(湖南省產商品質量檢驗研究院，湖南 長沙 410011)

發酵乳是一種口感風味俱佳的乳制品，富含多種營養成分，具有促進消化、防止乳糖不耐、降低膽固醇等多種功效，深受廣大消費者的喜愛[1-4]。目前，發酵乳的消費比例在中國液態乳制品中已高達50%[5]。

脂肪含有200多種不同類型的脂肪酸和大量甘油三酯，是發酵乳中風味物質及營養功效的主要來源[6-8]，同時也是發酵乳產品質量監測的重要指標，其在發酵乳中最常用的國家標準檢測方法為堿水解法[9-10]。但是在實際工作中發現，采用堿水解法測定含有羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的發酵乳中脂肪時，結果顯示偏低。由于發酵乳在生產過程中，通常會添加各類穩定劑保障其酸性體系的穩定性，而CMC-Na作為一種離子型纖維素膠，具有增稠、持水、乳化、懸浮等功能特點[11]，可防止酪蛋白聚集沉淀分層，并且價格低廉來源廣，被廣泛使用和研究[12-13]。但暫未發現關于CMC-Na影響發酵乳中脂肪測定的相關研究報道，僅宋艷梅等[14]研究表明果膠和明膠兩種不同穩定劑的添加使得發酵乳中脂肪測定結果偏低。因此，有必要深入了解CMC-Na的添加對發酵乳中脂肪檢測的影響。

研究擬通過深入分析堿水解法測定發酵乳中脂肪的技術原理，對含CMC-Na的發酵乳中脂肪測定偏低進行溯源分析，并對脂肪檢測方法進行特定條件優化，以期開發出具有更高準確度的含CMC-Na發酵乳中脂肪的檢測方法，為日常檢測判定提供新的技術思路，也為未來國標的修訂提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

全脂純牛奶：蒙牛乳業(集團)股份有限公司；

20款市售風味發酵乳：德人牧香、光明、蒙牛、伊利、認養一頭牛、德亞、君樂寶等多家企業不同系列產品(其中兩款含CMC-Na)，市售；

蔗糖：成都太古糖業有限公司；

發酵菌粉(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)：昆山佰生優生物科技有限公司；

羧甲基纖維素鈉：食品級，河南萬邦化工科技有限公司；

氨水、無水乙醇、無水乙醚、石油醚(沸程30～60 ℃)、鹽酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：SI-234型，丹佛儀器北京有限公司；

食品均質器：SJ-Ⅱ型，上海昆蟲科技開發公司；

生化培養箱：BD115E2型，德國Binder公司；

毛式抽脂瓶：容量100 mL，合肥市三元化玻儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS-28型，上海一恒科學儀器有限公司；

電熱鼓風干燥箱：DHG-9240A型，北京市永光明醫療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 制備含CMC-Na的發酵乳 將脂肪含量為3.91 g/100 g 的全脂純牛奶等量取樣7份，分別加入不同量的CMC-Na，配制成CMC-Na添加量分別為0.00%，0.10%，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%的牛奶樣品，再加入6%的蔗糖。將配制好的樣品在30 MPa 下均質處理，108 ℃滅菌15 min，取出后冷卻至40～45 ℃備用。各樣品按1 g/L依次加入發酵菌粉，充分攪拌混勻，放入42 ℃恒溫培養箱中發酵8 h，取出后放入4 ℃冰箱貯藏待測。

1.2.2 堿水解法關鍵條件的優化 對GB 5009.6—2016第三法堿水解法中關鍵條件進行優化調整。選擇氨水體積、水解溫度、水解時間、提取次數4個關鍵試驗參數，通過依次改變其中一個參數的水平條件，保持其他參數與國標方法相同(氨水體積2.0 mL，水解溫度65 ℃，水解時間20 min，提取次數3次)的情況下，對CMC-Na添加量為0.50%，0.75%，1.00%的3個發酵乳樣品逐一進行脂肪分析檢驗。其中，氨水體積的優化水平有4.0，6.0，8.0 mL；水解溫度的優化水平有75，80，85 ℃；水解時間優化水平有30，45，60 min；提取次數的優化水平有4，5，6次。最終對比條件優化后結果與國標方法結果的區別。

1.2.3 鹽酸水解對含CMC-Na發酵乳中脂肪測定的影響

參照堿水解中的參數條件，使用鹽酸替代氨水進行酸水解提取發酵乳中的脂肪。以市售含有CMC-Na的2款發酵乳產品，及CMC-Na添加量分別為0.00%，0.50%，0.75%，1.00%的自制發酵乳為研究對象，各取5份平行樣品，分別對應添加2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL 5個體積梯度的鹽酸，之后從水浴水解步驟開始按堿水解法中步驟操作。最后對比各試驗條件下的檢測結果，考察鹽酸水解對含CMC-Na發酵乳中脂肪測定的適用性。

1.2.4 堿水解法中加入金屬離子對含CMC-Na發酵乳中脂肪測定的影響 由于CMC-Na是一種聚電解質，當溶液中離子強度改變時，其黏度特性也會發生改變[15]，因此，針對CMC-Na含量不同(0.50%，0.75%，1.00%)的發酵乳，分別加入0.00，0.01，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 mol/L NaCl、KCl、CaCl2溶液，然后采用堿水解法對含有不同種類、不同濃度金屬離子的樣品進行脂肪測定，對比分析各金屬離子對含CMC-Na發酵乳中脂肪測定的影響。

2 結果與分析

2.1 基于國標堿水解法測定含CMC-Na發酵乳中脂肪的結果分析

依據GB 5009.6—2016堿水解法對20款市售風味發酵乳及自制CMC-Na含量不同的發酵乳進行脂肪測定，結果見表1。結果顯示，以CMC-Na為主要添加劑的兩款產品(編號1和編號2)脂肪檢測結果分別為2.33，2.35 g/100 g，遠低于標示值2.7，3.2 g/100 g，并且GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》規定風味發酵乳的脂肪含量不得低于2.5 g/100 g，由此可判定上述兩款產品脂肪不合格。而其余產品的脂肪檢測結果則與其標示值接近，且均符合產品標準合格要求，產品配料表顯示，其余產品并未添加CMC-Na，大部分以羥丙基二淀粉磷酸酯、乙?；矸鄱姿狨?、果膠、瓊脂等作為主要增稠劑。

表1 20款市售風味發酵乳中脂肪測定結果Table 1 Determination results of fat in 20 commercial flavor fermented milk g/100 g

此外，通過對CMC-Na添加量為0.00%，0.10%，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%的自制發酵乳中脂肪含量進行測定。檢測過程中發現，不含CMC-Na的對照樣管壁上光滑無附著物，含0.10%和0.25%CMC-Na的毛式脂肪管壁上有少量細小顆粒狀物質，但添加量超過0.50%后，毛式脂肪管壁上開始呈現膠狀物質，且隨著CMC-Na添加量的增加，膠狀物質增多，當添加量達到1.25%時，膠狀物質已基本覆蓋整個管壁。

從脂肪測定結果(圖1)可知，當CMC-Na添加量低于0.25%時，脂肪檢測結果基本持平，無明顯下降趨勢，但當CMC-Na添加量達到0.50%時，脂肪含量明顯下降，為3.74 g/100 g，比未添加CMC-Na的發酵乳下降0.17 g/100 g，而CMC-Na添加量為0.75%，1.00%，1.25%的發酵乳脂肪結果則分別為3.56，3.39，3.05 g/100 g，差值最高達到0.86 g/100 g。根據GB 5009.6—2016第三法規定，當樣品脂肪含量≤5%時，同一樣品兩次測定結果的絕對差值不應超過0.1 g/100 g，當CMC-Na添加量達到0.50%后，脂肪檢測結果隨CMC-Na添加量的增加而明顯減小，遠超出標準要求范圍。說明CMC-Na的加入可能造成國家標準方法堿水解法對發酵乳中脂肪檢測結果偏低，甚至造成產品的不合格判定。

圖1 不同CMC-Na含量的發酵乳脂肪測定結果Figure 1 Determination results of fat in fermented milk with different CMC-Na content

2.2 堿水解法關鍵條件的優化對含CMC-Na發酵乳中脂肪測定的影響

在國標方法的基礎上，逐一對堿水解法中氨水體積、水解溫度、水解時間、提取次數4個關鍵條件進行優化調整，對CMC-Na添加量為0.50%，0.75%，1.00%的發酵乳中脂肪進行測定，結果見圖2。從圖2可以看出，隨著氨水體積的增加、水解溫度的提高、水解時間的延長、提取次數的增加，不同CMC-Na添加量水平下發酵乳中脂肪的測定結果無明顯變化規律，均未提高，并且每個試驗條件變化下脂肪測定結果間的偏差值均在0.1 g/100 g的范圍內。由此可見，堿水解法中關鍵條件的參數變化對含CMC-Na發酵乳中脂肪檢測結果不會產生明顯影響，可能與CMC-Na的化學特性及發酵乳中脂肪的存在形式有關。

圖2 堿水解法中關鍵條件優化對含CMC-Na發酵乳中脂肪測定結果的影響Figure 2 Determination results of fat in fermented milk with CMC-Na by optimization test of key parameter in alkali hydrolysis

乳中脂肪主要由酪蛋白包裹以脂肪球的形式存在[16-17]，堿水解法通過氨水破壞酪蛋白膜而使脂肪球游離出來，再用有機試劑進行提取，而CMC-Na在發酵乳中的功能作用是通過其膠體特性吸附在酪蛋白表面形成交聯網狀結構，產生靜電排斥和空間位阻作用使發酵乳體系達到穩定[18]14。因此，針對含有CMC-Na發酵乳中脂肪的提取，必須先破壞CMC-Na的膠體作用。但CMC-Na黏度在pH 6～9時最大，pH 7時保護膠體性最佳，pH為10或更高時，對黏度影響較小甚至有微小增高現象[19-20]，因此，堿水解環境基本不影響CMC-Na的膠體性及黏度，使得堿水解過程中氨水很可能無法充分水解酪蛋白，使得脂肪無法得到充分釋放游離，造成脂肪抽提不完全。而且CMC-Na添加量越高，膠體覆蓋吸附酪蛋白越全面，有機溶劑抽提過程中不溶的膠狀物質越多，脂肪得到充分水解游離及完全抽提的概率越小，使得測定結果越低。因此，在堿性環境不變的情況下，以及無其他影響CMC-Na化學特性的因素存在下，僅通過改變氨水體積、水解溫度、水解時間以及抽提次數，并不會對脂肪的測定產生有效影響。

2.3 鹽酸水解對含CMC-Na發酵乳中脂肪測定的影響

在堿水解法中各參數條件不變的情況下，用不同體積的鹽酸代替氨水對含CMC-Na的發酵乳進行脂肪測定，結果見表2。由表2可知，2 mL鹽酸水解時，不含CMC-Na的發酵乳中脂肪測定結果，與堿水解法測定結果基本一致，并且CMC-Na添加量為0.50%，0.75%，1.00%時，2 mL鹽酸水解結果分別為3.90，3.89，3.92 g/100 g，與堿水解法測定不含CMC-Na發酵乳的結果偏差最高為0.02 g/100 g，在國標規定的0.1 g/100 g的允差要求內，可認為檢測結果一致。同時，采用2 mL鹽酸對市售兩款含有CMC-Na的產品進行水解，其脂肪測定結果分別為2.73，3.11 g/100 g，與標示值2.7，3.2 g/100 g接近。但隨著鹽酸體積的增加，脂肪測定結果逐漸提高，4 mL時，檢測結果提高了0.04～0.08 g/100 g，但基本還在偏差要求范圍內，但當鹽酸體積增至6 mL時，脂肪檢測結果有了明顯提升，偏差均超過了0.1 g/100 g，最高達到0.19 g/100 g，當體積增至8，10 mL時，結果基本穩定，但偏差最高達到0.27 g/100 g，并且提取物中出現黑色焦狀物。

表2 不同體積鹽酸水解對含CMC-Na發酵乳中脂肪測定結果的影響?Table 2 Determination results of fat in fermented milk containing CMC-Na by hydrolysis with different volumes of hydrochloric acid g/100 g

試驗結果表明，參照堿水解法中的參數條件，可采用2 mL鹽酸替代氨水水解含CMC-Na的發酵乳，其脂肪測定結果即可到達正常值。根據相關研究[21]，當pH降低時，CMC-Na體系部分負電荷得到中和，分子鏈卷曲，黏度減小，pH過低時則形成CMC-Na游離酸而沉淀，從而破壞了CMC-Na與酪蛋白的吸附，進而鹽酸水解脂肪球膜，釋放脂肪。但當鹽酸體積升高至6 mL及更高時，脂肪測定結果偏高且出現黑色焦狀物，有研究[22]表明該現象主要是由于分解物和水一同混入所致，當有機溶劑揮干后，則會產生黑色焦油狀物質；隨著鹽酸濃度的增大，可能導致樣品過度水解，同時加劇了糖類等物質的炭化，更多分解產物混入而使檢測值偏高。

2.4 金屬離子對堿水解法測定含CMC-Na發酵乳中脂肪的影響

2.4.1 Na+、K+對堿水解法測定含CMC-Na發酵乳中脂肪的影響 由圖3和圖4可知，Na+與K+的變化趨勢基本一致。Na+、K+的濃度越高，含CMC-Na發酵乳的脂肪測定結果越高，并在金屬離子濃度達到0.5 mol/L時，含不同濃度CMC-Na的發酵乳脂肪測定值基本達到穩定，與不含CMC-Na發酵乳的堿水解測定結果(3.91 g/100 g)一致。CMC-Na是一種陰離子型聚電解質，通過同性電荷的靜電排斥作用使得分子鏈得以伸展，呈現高黏度及穩定等特性[23]。研究[18]27[24]表明，加入Na+、K+后，溶液中離子強度發生改變，使得CMC-Na部分陰離子靜電場得到平衡，同性電荷的靜電排斥作用減弱，分子鏈卷曲體系粒徑變小，黏度降低；同時，使得陰離子聚合物pKa值降低，降低了CMC-Na與酪蛋白的吸附作用。因此，可能減弱了CMC-Na對氨水水解酪蛋白膜的阻礙，使得脂肪測定結果隨Na+、K+濃度的增加而增加，最終達到提取完全。

圖3 NaCl對堿水解法測定含CMC-Na發酵乳中脂肪的影響Figure 3 Effects of NaCl on determination of fat in fermented milk containing CMC-Na by alkali hydrolysis method

圖4 KCl對堿水解法測定含CMC-Na發酵乳中脂肪的影響Figure 4 Effects of KCl on determination of fat in fermented milk containing CMC-Na by alkali hydrolysis method

2.4.2 Ca2+對堿水解法測定含CMC-Na發酵乳中脂肪的影響 由圖5可知，Ca2+對含CMC-Na發酵乳中脂肪測定的影響與Na+、K+不同。隨著Ca2+濃度的增加，在低濃度0.01，0.05 mol/L時，脂肪的測定結果存在小幅的上升，隨后濃度再增加時，脂肪測定結果顯著下降，甚至低于未加金屬離子時的脂肪結果。研究[25-26]表明，Ca2+的加入，一開始時會因陽離子抵消了CMC-Na部分陰離子聚合電解質效應，使其黏度降低，與酪蛋白吸附成網狀結構的能力降低，因而脂肪測定結果會部分提高，但當鈣離子增加時，高分子會通過鈣發生螯合作用形成超結構，使得CMC-Na黏度進一步增加，與酪蛋白的結合更加牢固，可能導致氨水水解酪蛋白膜的效果更差，脂肪測定結果更低。

圖5 CaCl2對堿水解法測定含CMC-Na發酵乳中脂肪的影響Figure 5 Effects of CaCl2 on determination of fat in fermented milk containing CMC-Na by alkali hydrolysis method

3 結論

當發酵乳中CMC-Na添加量達到0.50%時，會使得脂肪含量的檢測結果明顯偏低，并且堿水解法中關鍵條件(氨水體積、水解時間、水解溫度、提取次數)的調整，不會提高含有CMC-Na發酵乳中脂肪測定的準確性。但當采用2 mL鹽酸水解含CMC-Na不同添加量(0.50%，0.75%，1.00%)的發酵乳時，即可使得其脂肪測定結果趨于正常；此外，通過在堿水解法中加入一定濃度的Na+或K+(0.5 mol/L及以上)，同樣可以改善含CMC-Na發酵乳的脂肪測定結果。

CMC-Na的添加對發酵乳中脂肪的測定存在不利影響，容易造成產品的不合格判定，在日常檢測中，需重點關注該現象，及時改進檢測方法，避免產品誤判。但是，隨著添加劑種類的增多，可能還有其他添加劑影響關鍵成分準確測定的現象出現，需要對日常檢測工作中的異?，F象進行及時總結，對相關添加劑的化學特性進行深入了解，從而推動國家標準方法的改進修訂，以保證產品質量的精準判定，同時也為企業對添加劑的選擇提供一定參考。