玉米胚芽粕制備蛋白膜工藝優化及抗氧化研究

張金鳳 王艷文 范恒軍 張宇婷

(綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061)

玉米胚芽粕中含粗蛋白質18%～20%，粗脂肪1%～2%，粗纖維11%～12%。其氨基酸組成與玉米蛋白飼料(或稱玉米麩質飼料)相似，屬于餅粕類。因為玉米胚芽粕中的玉米蛋白很容易被提取出來，并且損失率極低。玉米胚芽粕中的蛋白質的利用及研究已成為國內外學者研究的方向和課題。玉米醇溶蛋白是由肽鏈主鏈上的羥基和亞氨基之間的氫鍵形成的蛋白質混合物，富含含硫氨基酸，蛋白質分子間通過強二硫鍵和水分散鍵連接，具有良好的成膜性能。作為一種可再生的天然高分子蛋白，玉米醇溶蛋白具有生物降解性和生物相容性。它一方面可以單獨用作保鮮膜，另一方面也可以用作涂膜液，對果蔬的保鮮起到重要作用[1]。

目前，國內外對玉米醇溶蛋白膜的研究有很多：包括張雪娜等[2]利用超聲波萃取玉米蛋白粉中的玉米醇溶蛋白，再制備玉米醇溶蛋白膜并測定其機械性能；劉婷婷等[3]利用超聲波和微波制備了玉米醇溶蛋白—殼聚糖復合膜，得到了最佳工藝條件為超聲功率180 W，微波溫度50 ℃，協同作用時間6 min，攪拌速度300 r/min，制備的薄膜表面光滑，顆粒少；賈祥祥[4]以玉米醇溶蛋白為原料制備了蛋白質膜,通過單因素試驗得到工藝條件再測性能指標；在此基礎上作響應面試驗得最佳工藝；曹思遠等[5]以玉米醇溶蛋白為主要原料，以一定體積分數的乙醇為溶劑，甘油和油酸為增塑劑，研究了增塑劑用量、制備溫度和擠出壓力對玉米醇溶蛋白膜強度的影響；崔和平等[6]以玉米醇溶蛋白膜為原料制備蛋白質膜，加增塑劑和還原劑，通過單因素試驗采取響應面優化得最佳工藝，以提高玉米醇溶蛋白膜的水溶性。

從前人研究現狀可知，玉米醇溶蛋白膜原來僅限于玉米淀粉或者玉米蛋白粉，目前尚未有學者研究從玉米制油副產物玉米胚芽粕原料中提玉米醇溶蛋白制備蛋白膜。研究擬從玉米胚芽粉粕中提取玉米醇溶蛋白，加入一定量的增塑劑、還原劑改善玉米蛋白膜的性能不穩定性，深度加工形成質地均勻的、可降解的玉米醇溶蛋白膜，以期制備一種環保無污染可食用性包裝膜。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米胚芽粕：河北石家莊華仁飼料有限公司；

皇冠梨：市售；

正己烷、亞硫酸鈉、鹽酸、無水乙醇、無水亞硫酸鈉、丙三醇、氫氧化鉀、無水氯化鈣：分析純，天津市光復科技發展有限公司；

離心機：80-2B型，湖南星科科學儀器有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-6型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

電子分析天平：XS 365M型，上海衡平儀器表廠；

萬能粉碎機：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

超聲波儀：KQ-50B型，昆山市超聲儀器有限公司；

pH計：PHS-25(數顯)型，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米胚芽粕提取玉米胚芽蛋白工藝 借鑒許英一等[7]玉米胚芽蛋白提取工藝的優化，將新鮮玉米胚芽粕經高速萬能粉碎機粉碎后，室溫下按m玉米胚芽粕∶V正己烷=1∶2 (g/mL)的比例加正己烷脫脂過夜，蒸發溶劑備用。脫脂玉米胚芽粉用崔立平[8]研究確定的200目為最佳破碎程度的檢驗過篩目數，用1 mol/L的NaOH溶液[料液比為1∶14 (g/mL)、pH調為9.5]在恒溫水浴鍋60 ℃的水溫下加熱60 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心20 min，離心后取上層清液，在其加入1 mol/L的HCl溶液(pH調為4.2)在恒溫水浴鍋60 ℃的水溫下加熱30 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心30 min，取沉淀，制得玉米蛋白，用考馬斯亮藍測定蛋白含量。

1.2.2 玉米醇溶蛋白膜的制備 取一定量的玉米蛋白溶于一定體積分數的乙醇溶液中，再加入一定比例的增塑劑和還原劑。在功率180 W，時間5 min超聲輔助溶解，60 ℃恒溫水浴反應30 min得到蛋白膜溶液[2-3]。取75 mL的成膜液，倒入玻璃板中流延，自然晾干接膜保存在相對潮濕的環境中等待后續試驗備用。

1.2.3 膜性能的測定

(1) CO2透過率：在含有5 mL蒸餾水的試管中加入氫氧化鉀直至飽和。用所制得的蛋白膜覆蓋試管口處，用皮筋扎緊稱重后置于空氣中，每天稱重兩次，連續稱5 d，以增加的重量計算二氧化碳透過率[9]。按式(1)計算CO2透過率。

PCO2=△m/(A×T)，

(1)

式中：

PCO2——二氧化碳透過速率，g/(m2·h)；

△m——錐形瓶的增加量，g；

A——膜的面積，m2；

T——測定時間間隔，h。

(2) 水溶性：根據文獻[10]并修改，將蛋白質膜在75 ℃ 的干燥箱中干燥至恒重，準確稱重后，放入裝有50 mL蒸餾水的錐形瓶中，并將瓶口密封，防止灰塵進入和水蒸發。室溫溶解3 h，將倒干水后的薄膜在105 ℃ 干燥至恒重，稱重。根據蛋白質膜溶解前后的重量變化計算其水溶性。按式(2)計算水溶性。

w=(m1-m2)/m1×100%，

(2)

式中：

w——水溶性，%；

m1——溶解前樣品的質量，g；

m2——溶解后樣品的質量，g。

(3) 水蒸氣透過率：參照李磊等[11]的擬杯子法。將取下來的薄膜密封在裝有4 g無水氯化鈣的錐形瓶中(需稱量至恒重)，并將錐形瓶放置于(90±2)%相對濕度和(25±2) ℃溫度下，定時從干燥器中取出并測量增重。按式(3)計算水蒸氣透過率。

T=(W2-W1)/W1×100%，

(3)

式中：

T——水蒸氣透過率，%；

W1——未吸水時小錐形瓶的初始重量，g；

W2——定時吸水后小錐形瓶的重量，g。

1.2.4 不同因素對玉米醇溶蛋白成膜的影響

(1) 丙三醇添加量對玉米醇溶蛋白膜性能的影響：分別準確稱取6 g玉米蛋白，按m玉米蛋白∶V正己烷=1.0∶6.5 (g/mL)加入體積分數70%的乙醇，在超聲波功率為180 W下，超聲6 min后加入質量分數分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/g醇溶蛋白的甘油(丙三醇)和0.2 g的無水亞硫酸鈉，研究丙三醇添加量對玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影響。

(2) 乙醇體積分數對玉米醇溶蛋白膜性能的影響：分別準確稱取6 g玉米蛋白，按m玉米蛋白∶V正己烷=1.0∶6.5 (g/mL)加入乙醇體積分數分別為70%，75%，80%，85%，90%的乙醇，在超聲波功率為180 W下，超聲6 min后加入0.3 g/g醇溶蛋白的甘油(丙三醇)和0.2 g的無水亞硫酸鈉，研究乙醇體積分數對玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影響。

(3) 超聲時間對玉米醇溶蛋白膜性能的影響：分別準確稱取6 g玉米蛋白，按m玉米蛋白∶V正己烷=1.0∶6.5 (g/mL) 加入體積分數為70%的乙醇，在超聲波清洗機功率為180 W下，分別超聲4～8 min后加入0.3 g/g醇溶蛋白的甘油(丙三醇)和0.2 g的無水亞硫酸鈉，研究超聲時間對玉米胚芽粕蛋白膜性能的影響。

(4) 水浴溫度對玉米醇溶蛋白膜性能的影響：分別準確稱取6 g玉米蛋白，按m玉米蛋白∶V正己烷=1.0∶6.5 (g/mL) 加入體積分數為70%的乙醇，在超聲波清洗機功率為180 W下，超聲6 min后加入0.3 g/g醇溶蛋白的甘油(丙三醇)和0.2 g的無水亞硫酸鈉，在恒溫水浴鍋水溫分別為40，50，60，70，80 ℃下恒溫水浴反應30 min，研究水浴溫度對玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影響。

1.2.5 正交試驗優化制膜條件 根據單因素試驗結果，設計四因素三水平的正交試驗進一步優化，得到最優的組合。

1.2.6 抗氧化活性研究 以褐變指數反映抗氧化活性。選用新鮮的市售皇冠梨，梨表面光滑、無傷痕/黑色斑點，把梨切成切片，按最優結果制備玉米胚芽粕醇溶蛋白膜液，成膜液立即涂抹在新鮮、無褐變、無霉變的切片上，室溫平放放置6 h，每隔1 h觀察梨切片的褐變情況并進行褐變指數測定，同時做涂膜空白對照試驗。

褐變指數是由8名經驗豐富的感官評價人員采用觀察法評價和計算。褐變程度分為6個等級，分別以數字0、1、2、3、4、5來表示[12]，見表1。按式(4)計算每個樣品的褐變指數。

表1 褐變程度對照表Table 1 Comparison table of degree of browning

IB=∑(PB×SN)/TNP，

(4)

式中：

IB——褐變指數；

PB——褐變級數；

SN——該級片數；

TNP——總片數。

2 結果與分析

2.1 丙三醇添加量對玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影響

由圖1(a)可知，隨著丙三醇含量的增加，蛋白質膜的水溶性先降低后升高，這是因為當丙三醇添加量極少時，丙三醇分子容易與蛋白質分子鏈的氨基酸殘基和側鏈基團形成氫鍵，阻礙了蛋白膜的吸水性。當甘油添加量達0.20 g/g 醇溶蛋白時蛋白膜水溶性最小，為24.96%。但是丙三醇含有親水性羥基，丙三醇添加量增大時與醇溶蛋白發生反應，阻斷疏水殘留物，視蛋白結構展開，將埋藏的親水區域暴露出來，所以蛋白膜的水溶性開始變得越來越大。

由圖1(b)可知，隨著丙三醇含量的增加，玉米醇溶蛋白膜的CO2透過率先降低后升高。丙三醇含量對CO2透過率的影響在一定范圍內不顯著，但隨著丙三醇含量的增加，影響開始顯著[13]。這是因為甘油用量少時，很難從環境中吸收水分，空間結構穩定，二氧化碳的傳輸速率小。隨著甘油含量的增加，蛋白質分子間的羥基數目增加，從環境中吸收更多的水分子，導致膜空間連接處變得致密疏松，CO2透過性增加，膜阻隔性能惡化，當丙三醇添加量為0.2 g/g醇溶蛋白時，CO2通過膜的透過率最小，為0.28 g/(m2·h)。

由圖1(c)可知，隨著丙三醇添加量的逐漸增加，玉米醇溶蛋白膜的水蒸氣透過率先下降后逐漸增加，當丙三醇添加量為0.2 g/g醇溶蛋白時，膜的水蒸氣透過系數最小，為6.93 g·mm/(m2·d·kPa)。這是因為非極性基團的數量和分布的影響，丙三醇與玉米醇溶蛋白反應后，溶液極性周圍發生變化。而在其他點膜的水蒸氣透過率效果較差，這是因為丙三醇添加量較少時，醇溶蛋白空間結構穩定不被破壞，無法大量吸收水分。在添加量為0.5 g/g醇溶蛋白時，效果最差，這是因為丙三醇含有親水性羥基，加入丙三醇后與醇溶蛋白發生反應，阻斷疏水殘留物，視蛋白結構展開，將埋藏的親水區域暴露出來，所以吸水最多，水蒸氣透過率最高。

圖1 丙三醇添加量對玉米醇溶蛋白膜性能的影響Figure 1 Effect of glycerol addition on the performance of zein membrane

2.2 乙醇體積分數對玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影響

由圖2(a)可知，隨著乙醇體積分數的增加，蛋白質膜的水溶性也逐漸增加。在乙醇體積分數達到75%之前，有一個非常明顯的上升趨勢。當乙醇體積分數達到75%時，趨勢趨于平緩，是因為乙醇體積分數越高，成膜液揮發越快，不利于蛋白質中氫鍵和S—S鍵的形成，導致蛋白質膜結構不夠致密，分子間間隙較大，水溶性增大[14]。但此蛋白膜一般應用于蔬菜水果的保鮮上，因此蛋白膜的水溶性越小越好，綜上，乙醇體積分數為70%時，蛋白膜的水溶性最小(21.67%)。

由圖2(b)可知，蛋白膜的CO2透過率隨乙醇體積分數的增加呈先減少再增多后平緩的趨勢，這是由于一定體積分數的乙醇有助于提高蛋白分子間的相互作用，使其結構更致密，CO2透過率降低，但當乙醇體積分數突然增大時，阻礙了蛋白質分子間的作用，使其結構被干擾，故CO2透過率變大[15]。當乙醇體積分數為75%時，蛋白膜的CO2透過率最小，為0.26 g/(m2·h)。

由圖2(c)可知，水蒸氣透過率呈先下降后上升趨勢，這是因為低濃度不利于玉米醇溶蛋白分子間的交聯，玉米醇溶蛋白完全溶解，熱組織，分子間隙小，可以形成均勻的網絡結構，有效防止水蒸氣的滲透。但過高的乙醇體積分數不利于分子流動，導致成膜不均勻、網格結構和間隙過大，進而導致水蒸氣透過率的增加。乙醇體積分數為75%時，水蒸氣透過率值最低，為6.36 g·mm/(m2·d·kPa)。

圖2 乙醇體積分數對玉米醇溶蛋白膜性能的影響Figure 2 Effect of ethanol concentration on the performance of zein membrane

2.3 超聲時間對玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影響

由圖3(a)可知，超聲時間的不同對膜水溶性有顯著性影響，且隨超聲時間的增大，膜的水溶性呈先減小后增加的趨勢。這是由于超聲波主要是以散發熱量為主要形式，在這種環境下吸收能量，以此來提高水解反應速率，當超聲時間較短時，會引起空化作用，導致部分底物被破壞，水解反應受到抑制，隨著超聲時間的增加，反應充分，蛋白分子需結合更多的水分子達到平衡，故水溶性又開始變大[16]。當超聲時間為6 min時，膜的水溶性最小，為18.27%。

由圖3(b)可知，隨著超聲時間的增加，蛋白質膜的CO2透過率先減小后增大，然后趨于平緩。這是因為適當的超聲時間有助于改善蛋白質分子間的相互作用，使結構更加緊密，CO2透過率降低。但隨著超聲時間的增加，蛋白質分子間的相互作用受阻，結構受到干擾，CO2透過率增加。超聲時間為6 min時，蛋白膜穩定，玉米醇溶蛋白膜的CO2透過率最小，為0.28 g/(m2·h)。

由圖3(c)可知，超聲時間的不同對膜水蒸氣透過率有顯著性影響，且隨超聲時間的增大，膜的水蒸氣透過率先減小后增大。這是因為適當的超聲時間有助于改善蛋白質分子間的相互作用，使其結構更加緊密，降低水蒸氣的滲透性。但隨著超聲時間的增加，蛋白質分子間的相互作用受阻，結構受到干擾，水蒸氣透過率增加。超聲時間為6 min時，膜的水蒸氣透過系數最小，為8.76 g·mm/(m2·d·kPa)。

圖3 超聲時間對玉米醇溶蛋白膜性能的影響Figure 3 Effect of ultrasound time on zein membrane performance

2.4 水浴溫度對玉米胚芽粕醇溶蛋白膜性能的影響

由圖4(a)可知，隨著水浴成膜溫度的升高，玉米醇溶蛋白膜的水溶性先減小后增大。這可能是由于適當提高成膜溫度改變了蛋白質的三維結構，分子中的疏水基團、—SH和疏水氨基酸側鏈殘基充分暴露，而蛋白質分子通過水分散鍵和S—S鍵的結合形成更緊密的蛋白質網絡結構，從而降低膜的水溶性[17]。但當水浴溫度達到一定值時，成膜液的流動性隨溫度的升高而增大，導致溶劑蒸發迅速，成膜時間縮短，反應不足。成膜分子在分子間有序交聯形成相對規則的聚集狀態之前，會過早沉積和固定，薄膜中的水分含量也會降低，會吸收外界的水分，造成水溶性變大。當水浴溫度為60 ℃時，膜的水溶性最小，為19.64%。

由圖4(b)可知，玉米醇溶蛋白膜CO2透過率隨水浴時間的增加呈先減少再增多后平緩的趨勢。這是由于適當提高水浴溫度有助于水分和乙醇的蒸發，成膜液黏度下降，流動性增大，大分子聚合物片段移動加快，蛋白質分子通過疏水鍵、S—S鍵的結合形成比較嚴密、更緊湊的蛋白質網狀結構，所以膜的CO2透過率會先降低，隨著溫度升高，蛋白開始明顯變性，導致空間結構疏松，CO2透過率又開始增大。當水浴溫度為60 ℃時，玉米醇溶蛋白膜的 CO2透過率最小，為0.39%。

由圖4(c)可知，水浴溫度的不同對膜水蒸氣透過率有顯著性影響，且隨著水浴溫度的增大，蛋白膜的水蒸氣透過率呈先降后升的趨勢。這可能是由于適當提高成膜溫度改變了蛋白質的三維結構，使分子中的疏水基團、—SH 和疏水氨基酸側鏈殘基充分暴露，而蛋白質分子通過水分散鍵和S—S鍵的結合，形成更緊密的蛋白質網絡結構，使膜的水蒸氣透過率變小。隨著水浴溫度升高，蛋白開始明顯變性，導致空間結構疏松，膜的水蒸氣透過率又開始增大。當水浴溫度為60 ℃時，膜的水蒸氣透過系數最小，為7.68 g·mm/(m2·d·kPa)。

圖4 水浴溫度對玉米醇溶蛋白膜性能的影響Figure 4 Effect of water bath temperature on the performance of zein membrane

2.5 正交試驗

正交試驗因素水平設計見表2。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factor level table of orthogonal test

由表3可以看出，4種因素對玉米醇溶蛋白膜水溶性的影響順序為A>C>D>B，對玉米醇溶蛋白膜水蒸氣透過率的影響順序為A>C>B>D，對玉米醇溶蛋白膜CO2透過率的影響順序為A>C>B>D；通過正交試驗確定A3B3C1D3為最優組合，即丙三醇添加量為0.3 g/g醇溶蛋白，乙醇體積分數為80%，超聲時間為5 min，水浴溫度為70 ℃。與正交表中的最優組合A3B2C1D3有差異，需要做一組(3個平行)驗證實驗確定最優組合，比較兩個組合的3個性能見表3。驗證實驗得出，丙三醇添加量為0.3 g/g玉米蛋白，乙醇體積分數為80%，超聲時間為5 min，水浴時間為70 ℃是最優的組合。

表3 正交試驗結果分析表Table 3 Orthogonal test results analysis table

2.6 抗氧化活性

由圖5可以看出，隨著反應時間的延長，兩組樣品切片顏色都在逐漸加深。涂膜處理的樣品切片褐變指數的上升速度明顯低于涂膜空白組，可見玉米胚芽粕醇溶蛋白膜在食品保鮮上效果得到增加，褐變速度降低，能起到抗氧化護色的目的。

表4 組合A3B2C1D3與組合A3B3C1D3的比較Table 4 Comparison of combination A3B2C1D3 and combination A3B3C1D3

圖5 褐變指數與反應時間的關系Figure 5 The relationship between browning index and reaction time

3 結論

玉米胚芽粕是玉米深加工的副產品，通常作為飼料使用，造成資源的過度浪費。其中，玉米胚芽粕的蛋白質含量約為18%～20%，與玉米胚芽基本一致。利用玉米胚芽粕為原料制備醇溶蛋白膜，以水溶性、CO2透過率以及水蒸氣透過率為指標，通過單因素試驗和正交試驗研究4種因素對玉米胚芽粕蛋白膜性能的影響。結果表明：在丙三醇添加量為0.3 g/g醇溶蛋白、超聲時間為5 min、乙醇體積分數為80%、水浴溫度為70 ℃的條件下，玉米醇溶蛋白膜水溶性為19.75%、CO2透過率為0.21 g/(m2·h)、水蒸氣透過率為6.13 g·mm/(m2·d·kPa)。在優化玉米醇溶蛋白膜制備工藝的基礎上，對玉米醇溶蛋白膜的抗氧化性進行了研究，發現其具有一定的抗氧化保鮮效果。后續將進一步研究明膠、殼聚糖等物質對以玉米胚芽粕為原料制備的玉米醇溶蛋白膜穩定性的影響。