莓茶決明子固體飲料對(duì)大鼠慢性酒精肝損傷的保護(hù)作用

湛 莉 湯荃荃 張梓瑩 石 昱 滕建造 劉子龍 劉仲華 張 盛

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 湖南艾嘉生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410301)

酒精性肝損傷(ALD)是因長(zhǎng)期過量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，通常表現(xiàn)為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎，并逐步演變成肝纖維化、肝硬化，甚至是肝癌等[1]。常用于治療酒精性肝損傷的方法是藥物治療和手術(shù)治療[2]，但兩者存在較大副作用[3]。

莓茶又名藤茶，學(xué)名為顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)[4]，具有顯著的抗炎、抗氧化[5]、抗菌[6]、保肝[7-8]等功效。莓茶中的二氫楊梅素可改善肝纖維化[9]，總黃酮可有效縮短小鼠醒酒時(shí)間[10]。其他活性成分如莓茶多糖對(duì)小鼠體內(nèi)肝組織 MDA的生成也具有顯著抑制作用。

決明子(Cassiasemen)是中國(guó)傳統(tǒng)藥食兩用資源[11-12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，決明子蒽醌等成分可以通過調(diào)節(jié)Nrf2介導(dǎo)的ERK/MAPK/JNK等信號(hào)通路起到肝臟保護(hù)作用。

研究擬建立酒精性肝損傷SD大鼠模型，用不同劑量莓茶決明子固體飲料灌胃模型大鼠，通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定莓茶提取物和決明子提取物顆粒配比，分析模型大鼠肝臟指數(shù)、病理學(xué)指標(biāo)、血清和肝臟生化指標(biāo)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析探究莓茶決明子固體飲料對(duì)大鼠酒精肝損傷的保護(hù)作用，以期實(shí)現(xiàn)植物固體飲料在功能食品領(lǐng)域的深度開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

莓茶提取物、決明子提取物：湖南艾嘉生物科技有限公司；

大鼠正常肝細(xì)胞BRL3A：武漢普諾賽生命科技有限公司；

雄性SD大鼠：SPF級(jí)，體重180～220 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

MEM培養(yǎng)基：上海中喬新舟生物科技有限公司；

FBS(胎牛血清)：賽業(yè)生物科技有限公司；

雙抗(青霉素、鏈霉素)、EDTA-胰蛋白酶消化液：北京酷來搏科技有限公司；

RNA裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒：美國(guó)Vazyme有限公司；

細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(CCK8)：北京索萊寶科技有限公司；

ELISA檢測(cè)試劑盒：長(zhǎng)沙奧基生物科技有限公司；

D-hanks平衡鹽溶液：實(shí)驗(yàn)室配制；

43%vol牛欄山陳釀：市售；

CO2培養(yǎng)箱：BPN-80CW(UV)型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：BWS-27型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

超凈工作臺(tái)：Protect-1FD型，賽默飛世爾科技公司；

冷凍離心機(jī)：Hettich MIKRO-22R型，德國(guó)Hettich公司；

倒置顯微鏡：DMIL型，德國(guó)Leica有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：MK3型，賽默飛世爾科技公司。

1.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

1.2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)基：10%FBS(胎牛血清)+MEM培養(yǎng)基+1%P/S(雙抗)。

(2) 母液制備：將莓茶提取物和決明子提取物分別溶解于蒸餾水中，37 ℃水浴超聲至完全溶解，過0.45 μm細(xì)菌過濾膜，配制成20 mg/mL的莓茶提取物母液和決明子提取物母液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩o水乙醇過0.22 μm細(xì)菌過濾膜后保存?zhèn)溆谩?/p>

(3) 細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞增殖密度為80%～90%時(shí)將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基倒出，用D-hanks清洗2～3次，根據(jù)培養(yǎng)皿大小加入0.5～1.0 mL EDTA消化液，放入CO2培養(yǎng)箱靜置1 min。取出培養(yǎng)皿并向其中加入1～2 mL培養(yǎng)基混勻終止消化，用移液槍將貼壁細(xì)胞輕輕吹打下來，移入15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入1～2 mL培養(yǎng)基與收集的細(xì)胞輕輕吹打均勻，分別接種在2～3個(gè)培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中增殖培養(yǎng)。

(4) 毒性試驗(yàn)：取培養(yǎng)皿貼壁細(xì)胞消化離心，棄上清，收集細(xì)胞加入1 mL培養(yǎng)基吹打均勻，吸取10 μL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞密度過大稀釋10～20倍再計(jì)數(shù)。計(jì)算得到1 mL培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)量后按需稀釋細(xì)胞，接種于96孔板培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。24 h后移除96孔板上清。分別取莓茶提取物和決明子提取物母液700 μL，配制成質(zhì)量濃度為10 000.00,5 000.00,2 500.00,1 250.00,625.00,312.50,156.25,78.13,39.06 μg/mL溶液，分別加入同體積培養(yǎng)基混勻。空白組僅含培養(yǎng)基。乙醇以培養(yǎng)基稀釋，初始體積分?jǐn)?shù)為20%，稀釋至0.078%，方法同上。

溶液配制完成后加入96孔板中進(jìn)行干預(yù)，各質(zhì)量濃度6個(gè)平行，每孔加入100 μL溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后移除上清，加入90 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱靜置1.5～2.0 h后，檢測(cè)450 nm處吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。酒精干預(yù)是48 h后進(jìn)行吸光度檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞存活率。最終得出莓茶提取物和決明子提取物安全質(zhì)量濃度范圍及適宜酒精損傷的體積分?jǐn)?shù)范圍。確定莓茶提取物和決明子提取物安全質(zhì)量濃度范圍后設(shè)置莓茶決明子固體飲料顆粒配比，并進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞存活率，確定安全質(zhì)量濃度范圍并分析固體飲料對(duì)大鼠酒精肝細(xì)胞模型細(xì)胞存活率的影響。

分別按式(1)、式(2)計(jì)算試驗(yàn)組和空白組細(xì)胞存活率。

(1)

(2)

式中：

RA——試驗(yàn)組細(xì)胞存活率，%；

RB——空白組細(xì)胞存活率，%；

A——試驗(yàn)組細(xì)胞在450 nm處的光密度值；

B——空白組細(xì)胞在450 nm處的光密度值；

n——試驗(yàn)平行個(gè)數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞RNA提取及QPCR試驗(yàn) 按照RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(引物序列見表1)步驟檢測(cè)不同體積分?jǐn)?shù)酒精損傷細(xì)胞后的Nrf2、HO-1的表達(dá)量，確定適合損傷的酒精體積分?jǐn)?shù)。根據(jù)確定的酒精體積分?jǐn)?shù)檢測(cè)莓茶決明子固體飲料顆粒配比對(duì)BRL3A細(xì)胞存活率的影響。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物試驗(yàn) 飼養(yǎng)環(huán)境保持12 h光照和黑暗交替，室溫控制在(25±2) ℃，相對(duì)濕度40%～60%。40只SD大鼠隨機(jī)分成空白組(CON)、模型組(ETOH)、固體飲料組。固體飲料組分低劑量組(L)、中劑量組(M)、高劑量組(H)，每組各8只，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，第2周開始灌胃，每周2次體重稱量；空白組灌胃7.5 mL/kg蒸餾水；模型組灌胃5 mL/kg蒸餾水，固體飲料組灌胃5 mL/kg固體飲料水溶液(L:50.00 mg/kg莓茶提取物+16.70 mg/kg決明子提取物；M:250.00 mg/kg莓茶提取物+83.50 mg/kg 決明子提取物；H:375.00 mg/kg莓茶提取物+125.25 mg/kg決明子提取物)，灌胃1 h后，模型組和固體飲料組大鼠第1～29 d灌胃43%vol白酒2.5 mL/kg，第30天灌胃43%vol白酒4 mL/kg。

1.3.2 樣品的采集與處理 末次灌胃后，各組大鼠空腹(禁食禁水)16 h后稱重，將大鼠麻醉后進(jìn)行解剖，采集心臟動(dòng)脈血，摘取肝臟，預(yù)冷生理鹽水潤(rùn)洗后稱重，取一葉肝臟用4%多聚甲醛固定液固定，制作肝組織切片，后期進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，其余肝臟分裝后于液氮速凍，-80 ℃ 冰箱保存。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測(cè)

(1) 肝臟病理學(xué)檢查：剪取肝臟一葉組織浸入4%多聚甲醛中固定，制作石蠟切片，蘇木精—伊紅(HE)染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞的形態(tài)變化、炎癥反應(yīng)、脂肪空泡等病理變化。

(2) 血清生化指標(biāo)：取心臟動(dòng)脈血，靜置2 h，3 000 r/min 離心15 min，取上層血清，按照ELISA試劑盒方法檢測(cè)ALT、AST、LDH活性和IL-6、TNF-α濃度，其余血清保存于-80 ℃冰箱。

(3) 肝臟生化指標(biāo)：用預(yù)冷生理鹽水沖洗肝臟組織并制備10%肝臟組織勻漿，于4 ℃、3 000 r/min下離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書方法檢測(cè)SOD活性和TG、MDA、GSH含量。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 每組大鼠肝臟隨機(jī)取3份用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和差異基因表達(dá)分析。RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)過濾篩選后得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean data)，將各樣品的Clean Reads與指定參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，采用TPM方法計(jì)算基因表達(dá)量，DEseq2軟件篩選差異表達(dá)基因，篩選閾值為|log2(Fold change)|≥1和P值<0.05。篩選出上調(diào)和下調(diào)的差異基因并進(jìn)行GO功能注釋分析和KEGG富集分析從而篩選出差異基因富集通路[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均設(shè)置至少3組生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用GraphPad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA進(jìn)行分析。圖中*表示與正常組相比，#表示與模型組相比，*/#表示P<0.05；**/##表示P<0.01；***/###表示P<0.001；****/####表示P<0.000 1。P<0.05認(rèn)為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

莓茶提取物對(duì)細(xì)胞BRL3A的安全質(zhì)量濃度范圍為0.00～156.25 μg/mL[圖1(a)]，決明子提取物對(duì)細(xì)胞BRL3A的安全質(zhì)量濃度范圍為0.00～39.06 μg/mL[圖1(b)]。莓茶提取物安全質(zhì)量濃度最大值是決明子提取物的3～4倍，因此固體飲料的比例定為ρ莓茶提取物∶ρ決明子提取物=3∶1，在安全質(zhì)量濃度范圍內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，測(cè)定固體飲料的安全配比(ρ決明子提取物∶ρ莓茶提取物)范圍為0～30∶90[圖1(c)]。當(dāng)細(xì)胞存活率為50%左右時(shí)的酒精濃度適宜損傷，因此適宜損傷細(xì)胞的酒精體積分?jǐn)?shù)為2.5%～5.0%[圖1(d)]。

圖1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Cytotoxicity test results

2.2 酒精性肝損傷動(dòng)物模型的確立

Nrf2是一種重要的細(xì)胞保護(hù)轉(zhuǎn)錄因子，適度增強(qiáng)Nrf2活性可有效抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激，提高細(xì)胞存活率[15]。Nrf2活性過高會(huì)造成細(xì)胞氧化損傷，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性[16]。HO-1是一種抗氧化酶，正常生理狀態(tài)下，HO-1表達(dá)量較低，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥、感染時(shí)，HO-1表達(dá)量上升，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷[17]。為探究適宜損傷濃度的酒精處理BRL3A細(xì)胞48 h后Nrf2和HO-1的表達(dá)量及固體飲料配方對(duì)BRL3A細(xì)胞存活率的影響，進(jìn)行了QPCR試驗(yàn)，體積分?jǐn)?shù)為4.5%、5.0% 的酒精處理細(xì)胞后RNA濃度過低，未進(jìn)行后續(xù)QPCR試驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)，炎癥因子Nrf2和HO-1的表達(dá)量均顯著上升[圖2(a)、圖2(b)]，所以酒精體積分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)可有效建立酒精損傷模型。在安全質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，模型組(ETOH)與處理組細(xì)胞存活率顯著低于空白組(CON)，處理組(L、M、H)細(xì)胞存活率顯著高于模型組(ETOH)，說明固體飲料能夠有效緩解酒精造成的細(xì)胞存活率降低的問題[(圖2(c)])。

圖2 酒精模型的確立及固體飲料對(duì)其細(xì)胞存活率的影響Figure 2 Establishment of the alcohol model and effects of formulation on cell viability

2.2 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 大鼠肝系數(shù)情況 肝系數(shù)是指肝臟鮮重與大鼠重量的比值，正常情況下肝臟與體重的比值是恒定的，肝系數(shù)增大，表示肝臟水腫、炎癥或增生肥大；肝系數(shù)減小表示臟器萎縮或者其他退行性病變[18]。CON組、ETOH組及固體飲料組的肝系數(shù)無明顯差異性(P>0.05)，說明試驗(yàn)灌胃的酒精濃度對(duì)肝臟外在表征無顯著影響(表2)。

表2 各組大鼠肝系數(shù)Table 2 Hepatic index of each group rats

2.2.2 肝組織病理形態(tài) 由圖3可知，HE染色顯示CON組大鼠肝細(xì)胞肝索排列整齊，肝小葉、肝竇結(jié)構(gòu)清晰，無水腫、脂肪變性，有少量肝細(xì)胞死亡；ETOH組大鼠肝組織切片具有典型的病理特征，肝細(xì)胞大小不均，氣球樣變性，有較多小泡性脂肪空泡，同時(shí)伴有炎癥浸潤(rùn)、細(xì)胞壞死。相較于ETOH組，L組大鼠肝細(xì)胞水腫明顯改善，空泡變性減少，炎癥因子浸潤(rùn)減少，肝細(xì)胞排列紊亂情況有所改善。M組和H組與ETOH組相比，肝細(xì)胞形態(tài)趨于正常，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，細(xì)胞空泡變性明顯減少，偶有細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞排列與CON相比差異較小。綜上，莓茶決明子固體飲料可有效改善大鼠酒精性肝損傷的組織病理學(xué)病變。

圖3 大鼠肝組織H&E染色Figure 3 HE staining of rat liver tissue (40×)

2.2.3 大鼠血清生化指標(biāo) 臨床上，AST、ALT、LDH是反應(yīng)肝損傷的敏感指標(biāo)[17-18]，AST、ALT和LDH的活性升高與肝損傷呈正比。與CON組相比，ETOH組血清ALT、AST、LDH水平極顯著升高(圖4，P<0.000 1)，說明酒精肝損傷模型建立成功，提示肝細(xì)胞壞死、細(xì)胞膜通透性增加[18]。固體飲料各劑量組均可顯著抑制大鼠飲酒導(dǎo)致的AST、ALT、LDH的酶活增高，且效果呈劑量依賴性。

圖4 大鼠血清生化指標(biāo)水平Figure 4 Serum biochemical index levels in rats

2.2.4 IL-6和TNF-α水平 炎癥因子分泌是導(dǎo)致肝損傷的重要途徑。IL-6是促炎癥細(xì)胞因子，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。TNF-α在介導(dǎo)肝損傷中起一定作用，可直接導(dǎo)致細(xì)胞毒性，造成肝細(xì)胞壞死，影響肝內(nèi)微循環(huán)[19]。如圖5所示，與CON組相比，ETOH組血清炎癥因子IL-6、TNF-α水平極顯著升高，相對(duì)于ETOH組，固體飲料各劑量組均可極顯著降低炎癥因子水平(P<0.000 1)，且與劑量濃度呈正比。因此，莓茶決明子固體飲料可顯著減輕大鼠飲酒造成的炎癥反應(yīng)。

圖5 大鼠血清炎癥因子水平Figure 5 Rat serum inflammatory factor level

2.2.5 大鼠肝臟生化指標(biāo) 酒精代謝過程產(chǎn)生活性氧自由基，過多氧化劑會(huì)造成自由基脂質(zhì)過氧化，機(jī)體抗氧化酶GSH、SOD活性下降，抗氧化防御系統(tǒng)水平降低[20]。由圖6(a)、圖6(c)可知，與CON組相比，ETOH組大鼠肝臟中GSH、SOD含量均極顯著下降(P<0.000 1)。MDA是脂質(zhì)過氧化的第二產(chǎn)物，是反映組織損傷的重要指標(biāo)，ETOH組大鼠肝臟TG、MDA含量較CON極顯著升高(P<0.000 1)[圖6(b)、圖6(d)]。通過固體飲料干預(yù)，各劑量組GSH、MDA、TG濃度和SOD活性與ETOH組相比具有顯著差異(P<0.05)，固體飲料M、H組MDA含量與CON組無顯著差異(P>0.05)，H組SOD、TG含量與CON組無顯著差異(P>0.05)，結(jié)果表明固體飲料低中高劑量均可有效提高大鼠肝臟抗氧化酶的活力，加速清除氧自由基，緩解脂肪肝形成。

圖6 大鼠肝臟生化指標(biāo)水平Figure 6 Rat liver biochemical index levels

以上研究表明固體飲料低、中、高劑量組均能顯著降低血清中肝損傷酶活性和炎癥因子表達(dá)水平，抑制脂質(zhì)過氧化和脂肪肝的生成，且呈劑量依賴性，高劑量組效果最佳。

2.2.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)評(píng)估 將CON組、ETOH組和H組大鼠肝臟的RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與參考基因組進(jìn)行比對(duì)共得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)399 553 582個(gè)，經(jīng)質(zhì)控后得到測(cè)序數(shù)據(jù)395 459 552個(gè)。獲得的質(zhì)控后的測(cè)序數(shù)據(jù)中，所有樣品的唯一比對(duì)率均達(dá)到82%以上，Q20值均大于96%，Q30值均大于91%，表明測(cè)序數(shù)量和質(zhì)量可靠(見表3)。

表3 樣本測(cè)序質(zhì)量和序列?Table 3 Sample sequencing quality and sequence mapping

2.2.7 差異表達(dá)分析 根據(jù)1.3.4中篩選標(biāo)準(zhǔn)，ETOH組較CON組，共有229個(gè)基因表達(dá)存在顯著差異。ETOH組中有174個(gè)基因上調(diào)，55個(gè)基因下調(diào)。H組較ETOH組，共有106個(gè)基因表達(dá)存在顯著差異，H組中有69個(gè)基因上調(diào)，37個(gè)基因下調(diào)。H組較CON組，有72個(gè)差異基因，有31個(gè)基因上調(diào)，41個(gè)基因下調(diào)。由差異基因結(jié)果分析可知，在H組固體飲料的干預(yù)下，酒精肝損傷模型大鼠與正常大鼠的差異減小，表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖見圖7。

圖7 差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)Figure 7 Statistic analysis of the differentially expressed genes

2.2.8 差異表達(dá)基因的功能注釋和富集分析

(1) GO注釋：對(duì)ETOH組與CON組的229個(gè)差異基因以及H組與ETOH組的106個(gè)差異基因進(jìn)行注釋分析，注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)：分子功能分組主要涉及分子功能調(diào)節(jié)劑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、催化活性和結(jié)合等功能；生物過程分組主要涉及免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、定位、多細(xì)胞生物過程、發(fā)展過程、對(duì)刺激的反應(yīng)、代謝過程、生物調(diào)節(jié)等功能；細(xì)胞組分分組主要涉及胞外區(qū)部分、含蛋白質(zhì)復(fù)合物、膜、膜部分、細(xì)胞器部分、細(xì)胞器和細(xì)胞部分等功能(表4)。

(2) KEGG注釋：將ETOH組與CON組、H組與ETOH組差異基因進(jìn)行KEGG注釋分析，表5和表6顯示了酒精干預(yù)和固體飲料干預(yù)后上調(diào)和下調(diào)的差異基因涉及排名前20的通路情況。酒精干預(yù)后，上調(diào)和下調(diào)基因涉及代謝通路分支有代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程、有機(jī)系統(tǒng)、人類疾病，上調(diào)差異基因主要富集在運(yùn)輸和分解代謝、折疊、分類和降解、其他氨基酸代謝等通路，下調(diào)差異基因主要富集在細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、運(yùn)輸和分解代謝、氨基酸的代謝和脂質(zhì)代謝等通路(表5)。

表5 ETOH組與CON組差異基因KEGG分類統(tǒng)計(jì)Table 5 KEGG Classification chart CON group vs ETOH group

固體飲料干預(yù)后，上調(diào)和下調(diào)差異基因涉及人類疾病、有機(jī)系統(tǒng)、細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理遺傳信息處理和代謝等通路分支，上調(diào)基因富集包括癌癥、心血管疾病、免疫系統(tǒng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡等通路，下調(diào)差異基因富集包括氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、碳水化合物代謝等通路(表6)。

表6 H組與ETOH組差異基因KEGG注釋統(tǒng)計(jì)Table 6 KEGG comment statistics of Classification chart of H group and ETOH group

為明確酒精干預(yù)和固體飲料干預(yù)后的關(guān)鍵差異基因，進(jìn)行進(jìn)一步KEGG富集分析，其校正后的P值<0.05，為顯著富集。由表7可知，基因主要富集到氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、代謝途徑、精氨酸生物合成和碳代謝。結(jié)合上述結(jié)果，篩選出關(guān)鍵差異基因spermidinesynthase(亞精胺合酶)、Sirt7(去乙酰化酶7)、RT1-A2(RT1 class Ia,locus A2)、RT1-CE1(RT1 I類，軌跡1)、LOC103692716(熱休克蛋白 HSP 90-α)、Acap2(ArfGAP)，這些基因與肝臟功能、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化等相關(guān)。由此推測(cè)莓茶決明子固體飲料緩解酒精肝損傷與上述關(guān)鍵差異基因和通路相關(guān)。

表7 KEGG富集結(jié)果Table 7 KEGG enrichment results

3 結(jié)論

將莓茶提取物與決明子提取物顆粒配成的固體飲料應(yīng)用于酒精肝損傷的護(hù)肝功效研究，最終結(jié)果表明低、中、高劑量的固體飲料均能改善飲酒大鼠的肝功能，有效緩解酒精引起的肝損傷，且作用機(jī)制與spermidinesynthase、Sirt7、RT1-A2、RT1-CE1、LOC103692716、Acap2基因調(diào)節(jié)及氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、代謝途徑、精氨酸生物合成和碳代謝等通路有關(guān)。后續(xù)可進(jìn)一步挖掘數(shù)據(jù)探明更詳細(xì)的作用機(jī)制并開展莓茶與決明子的協(xié)同功效研究。