小鼠視神經損傷后視網膜中TLR-9與MyD88表達變化

李雪穎，李 迪，陳麗平，李 靜

0引言

外傷性視神經病變是常見的臨床問題，研究發現閉合性顱腦外傷的患者中有0.5%～5%伴隨有視神經損傷[1]。如發生顱面部骨折，視神經損傷(optic nerve injury，ONI)的發生率上升為10%[2]。目前對于外傷性視神經損傷主要的治療方法還是視神經管減壓術、糖皮質激素治療、營養神經治療及改善循環治療[3]。研究報道視神經管減壓術治療外傷性視神經病變的有效率為50%～60%[4-5]。而藥物、基因、干細胞移植等一些治療方法的效果也不確切。目前創傷性視神經損傷的治療仍是臨床面臨的難題。

Toll樣受體-9(Toll like recepter 9，TLR-9)是Toll樣模式識別受體家族成員之一，是Hemmi等[5]在2000年發現的Tolls家族新成員，表達于免疫細胞，通過與細菌DNA作用而誘導機體的固有免疫反應。髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是TLR-9和其他TLRs的銜接分子[6-7]。近年發現TLR-9在很多疾病進程中起重要作用，而TLR-9是否參與視神經損傷的病理過程鮮見報道。本實驗旨在研究TLR-9及其銜接分子MyD88在視神經損傷后的變化特點，為視神經損傷病變的治療提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料選取清潔級8周齡雄性C57BL/6J小鼠36只，無眼疾(由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供)。動物飼養保持12h晝夜交替的生物節律，能自由飲用水和食物，室溫保持在20℃～24℃條件下每日定時清洗籠舍。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得陜西省人民醫院動物倫理委員會許可。隨機分為6組每組6只：空白對照組(未做任何處理)、ONI 1d組(視神經損傷后1d取材)、ONI 3d組(視神經損傷后3d取材)、ONI 5d組(視神經損傷后5d取材)、ONI 7d組(視神經損傷后7d取材)、ONI 14d組(視神經損傷后14d取材),分組后進行造模。

1.2方法

1.2.1視神經損傷模型1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，經顳側入路顯露左側視神經,延長軸方向剪開神經鞘,分離視神經,避免損傷視網膜中央動脈。于球后0.5～1mm處夾持視神經，夾持時間為5s。手術完術眼涂紅霉素眼膏，放置于電熱毯上蘇醒。蘇醒后于動物房中正常飼養。1%戊巴比妥鈉腹腔注射安樂處死小鼠。模型制作成功標準:傷后10min瞳孔散大,間接對光反射存在,直接對光反射消失,且眼底明確未損傷大鼠眼動脈、眼底供血情況恢復良好。30只模型鼠經確認均建模成功。

1.2.2RT-qPCR 視神經損傷后1、3、5、7、14d利用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit試劑盒(QIAGEN, Germany)從小鼠視網膜提取總RNA，然后用逆轉錄酶Ⅲ(Invitrogen, USA)和寡核苷酸oligo-dT將總RNA轉錄成cDNA。用UNICONTM qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒(Yeasen,Shanghai,China)在StepOnePlus unit(Applied Biosystems, USA)實時熒光定量PCR儀上完成RT-qPCR檢測。方法：94℃預變性55s，然后進行一下循環：95℃變性30s，57℃退火30s，73℃延伸30s，共進行45個循環。然后再95℃變性10s，65℃退火45s，40℃延伸60s。使用2-△△Ct方法計算相對mRNA水平。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參。引物序列如下:TLR-9:正向引物,5’-GCA ATG TTC TAT ATG CAT TCT C-3’,反向引物,5’-TGA TAT TGG CAC ACC AAC AC-3’;MyD88:正向引物,5’-AGG GTC GCA CAG TGG GTG A-3’,反向引物,5’-CGT GTT CTC TTG CGC ATT CC-3’。

1.2.3Western-blot 視網膜組織在lysis buffer(Roche Biochemicals, USA)緩沖液中裂解。Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, USA)蛋白質分析試劑盒測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE(Invitrogen)分離等量的蛋白質，然后將其轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF, Millipore, USA)膜中。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1.5h后，將膜與一抗TLR-9(ab134368)(以1∶1000稀釋)、一抗MyD88(ab219413)(以1∶1000稀釋)和GAPDH(ab9485)(以1∶1000稀釋)在4℃下孵育過夜，將膜與辣根過氧化物酶偶聯的二抗山羊抗小鼠IgG(Bio-Rad,USA)(以1∶1000稀釋)或二抗山羊抗兔IgG(Bio-Rad)(以1∶1000稀釋)在常溫下孵育1.5h。用增強的化學發光試劑檢測蛋白條帶，并用Image J系統定量。GAPDH為內參。

2結果

2.1各組小鼠視網膜中TLR-9mRNA和TLR-9蛋白表達變化情況各組小鼠視網膜中TLR-9 mRNA的表達量比較差異有統計學意義(F=560.1，P<0.0001)，見表1。RT-qPCR結果見圖1。ONI 1d組視網膜中TLR-9 mRNA的表達量與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；ONI 3d、ONI 5d、ONI 7d、ONI 14d組視網膜中TLR-9 mRNA的表達量與空白對照組比較明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.01)。各組小鼠視網膜中TLR-9蛋白的表達比較差異有統計學意義(F=305.5，P<0.0001)，見表1。Western-blot結果見圖2。ONI 1d組視網膜中TLR-9蛋白的表達量與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；ONI 3d、ONI 5d、ONI 7d、ONI 14d組視網膜中TLR-9蛋白的表達量與空白對照組比較明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.01)。TLR-9 mRNA和TLR-9蛋白的變化規律為ONI 3d表達開始升高，ONI 5d達到頂峰，ONI 7d表達開始下降，ONI 14d表達依然高于空白對照組。

圖1 RT-qPCR檢測各組小鼠視神經損傷后TLR-9 mRNA的表達情況 bP<0.01 vs 空白對照組。

表1 各組小鼠視網膜中TLR-9和MyD88的表達情況

圖2 Western-blot檢測小鼠視神經損傷后TLR-9蛋白的表達情況 bP<0.01 vs 空白對照組。

2.2各組小鼠視網膜中MyD88mRNA和MyD88蛋白表達變化情況各組小鼠視神經損傷后視網膜中MyD88 mRNA的表達比較差異有統計學意義(F=439.3，P<0.0001)，見表1。RT-qPCR結果見圖3。ONI 1d組視網膜中MyD88 mRNA的表達量與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；ONI 3d、ONI 5d、ONI 7d、ONI 14d組視網膜中MyD88 mRNA的表達量與空白對照組比較均明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.01)。各組小鼠視神經損傷后視網膜中MyD88蛋白的表達比較差異有統計學意義(F=422.6，P<0.0001)，見表1。Western-blot結果見圖4，ONI 1d組視網膜中MyD88蛋白的表達量與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；ONI 3d、ONI 5d、ONI 7d、ONI 14d組視網膜中MyD88蛋白的表達量與空白圖3RT-qPCR檢測小鼠視神經損傷后MyD88mRNA的表達情況bP<0.01vs空白對照組。

對照組比較均明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.01)。MyD88 mRNA和MyD88蛋白的變化規律為ONI 3d表達開始升高，ONI 5d達到頂峰，ONI 7d表達開始下降，ONI 14d表達依然高于空白對照組。

3討論

視神經是中樞神經的一部分，是將視覺信息從眼部傳輸到大腦的重要結構，視神經損傷后會激活多種繼發性損傷機制，從而導致不可逆的視力損傷[8]。臨床對于視神經損傷的治療主要有手術治療和藥物，手術的有效率在一半左右，而藥物治療的療效也不確定，能不能有更好的治療方法來挽救視神經損傷患者的視力仍是我們要迫切解決的問題。

Toll樣受體(TLRs)家族是一類重要的表面模式識別受體，其信號通路是介導免疫細胞產生固有免疫應答的極為重要的機制。人類TLR家族已發現10個成員(TLR1～10)，可分為兩類：表達于細胞膜上和表達于胞內細胞器膜上。TLR-9表達于細胞器膜上，主要識別細胞質中的病毒或細菌[9]。TLRs可以在多種疾病中參與炎癥反應的過程[10-12]。有研究發現阻斷TLR介導的MyD88依賴的MAPK信號通路能夠減輕顆粒物誘導的炎癥反應[13]。也有研究發現TLR-9的缺乏會加重一些自身免疫性疾病的病情。有研究發現狼瘡傾向的Sle1小鼠與TLR-9缺乏的鼠雜交形成Sle1TLR-9小鼠，小鼠病情比Slel小鼠更加嚴重[14]。TLR-9在眼科相關疾病的研究少見報道，我們的研究發現視神經損傷后視網膜中的TLR-9 mRNA和TLR-9蛋白水平都顯著增加，與空白對照組比較具有統計學意義，這提示TLR-9可能在視神經損傷的病程中起重要作用。但是它對疾病的發展起到的是正向的作用還是負向的作用還有待我們進一步研究。

圖4 Western-blot檢測大鼠視神經損傷后MyD88蛋白的表達情況 bP<0.01 vs 空白對照組。

有研究發現，眶內視神經損傷后5～6d視網膜神經節細胞開始不可逆的凋亡[15]。我們的研究也發現了視神經損傷后TLR-9在視網膜中表達變化的規律，TLR-9的表達在視神經損傷后3d開始升高，損傷后5d達到頂峰，損傷后7d表達開始下降，TLR-9的表達早于神經節細胞開始凋亡的時間，TLR-9的升高可能與神經節細胞的凋亡有關。這也為我們后續的研究提供的一定的實驗基礎，也為治療干預的時間窗選擇提供了依據。

MyD88基因主要表達于免疫細胞中，最初在髓樣細胞的分化過程中被發現，是細胞質中的一種可溶性蛋白。MyD88是細胞內信號傳導的關鍵銜接蛋白，能夠介導多種Toll樣受體(TLRs)、白細胞介素1受體(IL-1R)及白細胞介素-18受體(IL-18R)的信號傳遞，在固有免疫中擔任重要角色[16]。研究發現大鼠視神經損傷后TLR-4與MyD88表達增加，脂肪干細胞移植能夠降低視神經損傷大鼠TLR-4與MyD88表達，改善大鼠的視功能[17]。Syeda等[18]對MyD88基因敲除小鼠的研究發現，與空白對照組相比基因敲除組促炎性細胞因子分泌顯著減少，激活的視網膜小膠質細胞數量減少、聚集減弱，視網膜光感受器細胞的凋亡壞死明顯減少。我們的研究發現小鼠視神經損傷后MyD88的表達變化規律與TLR-9的表達變化規律是一致的，這也證明TLR-9/MyD88信號通路與小鼠視神經損傷進程的相關性。MyD88激動劑和抑制劑可以調節MyD88的表達，從而在疾病中起到治療的作用。

視神經損傷的治療是臨床的難題，我們的研究發現TLR-9和MyD88可能是視神經損傷疾病病程進展過程的重要影響因素，調節TLR-9和MyD88的表達可能成這類疾病治療的一個靶點。