白樺酯醇對白樺懸浮細胞生長生理的影響

王勃 姜洋 詹亞光 范桂枝

摘要 以白樺懸浮細胞為試材，將0.1～5.0 μmol/L白樺酯醇添加到培養7 d的白樺細胞懸浮培養體系中處理12 h～14 d，采用比色法分析白樺懸浮細胞活力、丙二醛和NO含量等，解析白樺酯醇對白樺懸浮細胞生長生理的影響。結果表明，不同濃度白樺酯醇處理12 h～14 d，白樺懸浮細胞鮮重、活力、pH和電導率與同期對照相比無顯著差異，其最大值分別在處理后14 d、7 d、14 d和12 h;與同期對照相比，白樺酯醇處理后白樺懸浮細胞中MDA含量、超氧化物歧化酶活性和過氧化物酶活性及其基因表達水平基本呈增加趨勢，在處理14 d時達最大值;除1.0和5.0 μmol/L白樺酯醇處理顯著增加了白樺懸浮細胞中NO含量外，其他處理下NO和亞硝基硫醇含量與對照相比未產生顯著影響。可見0.1～5.0 μmol/L白樺酯醇對白樺懸浮細胞生長未產生顯著影響。

關鍵詞 白樺酯醇;白樺懸浮細胞;細胞活性;生長生理

中圖分類號 S718? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）10-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.001

Effects of Betulin on Suspension Cell Growth Physiology of Betula platyphylla

WANG Bo，JIANG Yang，ZHAN Ya-guang et al （College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040）

Abstract With birch suspension cells used as testing materials，betulin of 0.1-5.0 μmol/L was added into the culture system of suspension cells of Betula platyphylla for culturing 7 d to the treatment which lasted 12 h-14 d.Colorimetric method was applied to analyzing the cell viability，malondialdehyde and NO content of the suspension cells of Betula platyphylla，etc.，which helped to dissect and analyze the effects of betulin on the growth and physiology of suspension cells of Betula platyphylla.The results showed that after treatment with different concentrations of betulin for 12 h to 14 d，there was no significant difference in fresh weight，viability，pH and electrical conductivity of the suspension cells of Betula platyphylla compared with the control in the same period，and the maximum values were at 14 d，7 d，14 d and 12 h after treatment，respectively.Compared with the control in the same period，the MDA content，superoxide dismutase activity，peroxidase activity and gene expression levels in the suspension cells of Betula platyphylla after betulin alcohol treatment basically showed an increasing trend，and reached the maximum value at 14 days of treatment.Except for the treatment of 1.0 and 5.0 μmol/L betulin significantly increased the NO content in the suspension cells of Betula platyphylla，the content of NO and nitrosothiol under other treatments had no significant effect compared with the control.It could be seen that 0.1-5.0 μmol/L betulin had no significant effect on the growth of the suspension cells of Betula platyphylla.

Key words Betulin;Suspension cells of Betula platyphylla;Cell viability; Growth physiology

基金項目 黑龍江省自然科學基金項目（C2016005）;國家自然科學基金面上項目（32171829）。

作者簡介 王勃（1995—），女，內蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向：森林生物工程。通信作者，教授，博士，碩士生導師，從事植物細胞工程相關研究。

收稿日期 2021-11-16

萜類、酚類和含氮化合物等次生代謝物是由生物產生的非細胞生命活動或生物正常生長發育所必需的小分子化合物，它的合成和分布一般具有種屬、組織部位和生長發育時期的特異性[1]。植物產生的次生代謝物是其長期適應生存環境中與生物或非生物因素相互作用的結果，它被人類開發用于食品加工、醫藥、農藥和化工等領域[2]。目前對植物次生代謝物生物合成、運輸和累積的研究發現，植物細胞能夠產生多樣的特異性代謝產物，并能夠將其中一些代謝產物在細胞中積累至極高的濃度，如在專門的細胞類型中積累，或者將其螯合在細胞的液泡中[3-4]。然而，植物細胞中產生的次生代謝物對細胞自身的生長和生理等功能有何影響還不清楚。

白樺酯醇為羽扇豆烷型結構的三萜類化合物，它主要存在于酸棗仁、天門冬、石榴樹皮和葉、白樺樹皮和葉、羅勒、柿蒂和大棗等植物中，特別是在白樺樹皮中含量高達132.45～257.11 mg/g[5]。東北林業大學森林生物工程實驗室建立了產白樺酯醇的白樺懸浮細胞培養體系，但其含量僅為白樺樹皮中的1%左右[6]。同時研究發現，真菌誘導子、水楊酸、NO和多胺等生物或非生物誘導子均可以顯著提高白樺懸浮細胞中白樺酯醇等三萜物質的累積，含量由約1.0 mg/g提高到約20 mg/g，同時發現NO是介導上述誘導子促進白樺酯醇等三萜物質合成的一種重要信號分子[7-12]。因此，筆者以白樺懸浮細胞作為研究試材，研究外施白樺酯醇對白樺懸浮細胞生長和生理的影響，以期為解析次生代謝物對細胞自身的生長和生理功能等影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白樺懸浮細胞，白樺（Betula platyphylla Suk.）組培苗莖段誘導獲得白樺愈傷組織，將愈傷組織接種于B5液體培養基中獲得白樺懸浮細胞，每7 d繼代一次。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理。

試驗共設5個處理，即白樺酯醇濃度分別為0（對照）、0.1、0.5、1.0、5.0 μmol/L。供試白樺懸浮細胞在無菌條件下培養7 d，向培養基中加入白樺酯醇，分別處理12 h、7 d和14 d。每個處理使用3瓶細胞，每組中每個處理重復3次。

1.2.2 pH和電導率測定。

收集白樺懸浮細胞后置于50 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min，取上清液。分別利用pH計和電導率儀進行測定。

1.2.3 細胞活力測定。參照氯化三苯四氮唑（TTC）法[13]，精確稱取0.20 g白樺懸浮細胞后，加入2.5 mL磷酸緩沖液和2.5 mL 0.4% TTC后室溫暗處理14 h，去上清后用5 mL蒸餾水清洗細胞3次，去上清，加入5 mL 95%乙醇脫色處理，冷卻后于485 nm處測定吸光度。

1.2.4 丙二醛（MDA）含量測定。

參照《植物生理生化實驗原理和技術》[14]中試驗方法，精確稱取2.00 g白樺懸浮細胞后，加入5 mL蒸餾水研磨。將5 mL 0.5 mol/L硫代巴比妥酸（TBA）溶液和待測研磨液置于10 mL離心管中，沸水浴10 min，冷卻后3 000 r/min離心10 min，取上清液。分別測定450、532和600 nm處吸光度，根據公式計算白樺懸浮細胞中MDA含量：MDA含量=[6.45×（A532-A600）-0.56×A450]×提取液體積/（測定液體積×鮮重）。

1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性測定及基因表達。

1.2.5.1 酶粗提取液的制備。參照劉英甜等[11]試驗方法，精確稱取1.00 g白樺懸浮細胞于預冷研缽中，加入4 mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0）及少量交聯聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）充分研磨，4? ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液為酶粗提液。

1.2.5.2 SOD活性測定。將0.3 mL 酶粗提液和0.3 mL 提取液分別加入測定管和對照管中，同時分別加入1.5 mL 50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0）、0.3 mL 130 mmol/L 蛋氨酸（現用現配）、0.3 mL 750 mmol/L 氯化硝基四氮唑藍（現用現配）、0.3 mL 100 μmol/L 乙二胺四乙酸二鈉和0.3 mL 20 μmol/L 核黃素。反應20 min，將對照組置于黑暗中，試驗組于自然光下，反應20 min后測定560 nm處吸光度。

1.2.5.3 POD活性測定。將0.5 mL 酶粗提液、3.9 mL 50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0）、1.0 mL 2% 過氧化氫溶液、20 μL 0.05 mol/L愈創木酚混合均勻后立即測定470 nm處吸光度，1 min后再次測定470 nm處吸光度。

1.2.5.4 基因表達分析。采用北京全式金生物技術有限公司qPCR SuperMix試劑盒進行實時熒光定量PCR，對SOD、POD基因表達量進行分析?；虮磉_量的計算方法參照Livak等[15]方法，以白樺內參基因TU為內標參照，目的基因的相對表達量用2-△△CT[15]來表示。BpSOD上下游引物分別為F：ACAGTCAGGGTGTCAGTGGGA和R：CAGCAGGATTGAAATGTGGC;BpPOD上下游引物分別為F：AGGAACTTTAGGCACATCG和R：AGATGCTCTCATTGTGGTC。

1.2.6 NO含量測定。NO含量采用NO試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）進行測定。利用Griess法檢測細胞中NO含量，將白樺懸浮細胞培養液4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，取上清液，分別在空白管和測定管中加入提取液和樣品400 μL 后，加入試劑混勻，室溫靜置15 min后在550 nm下測定吸光度。

1.2.7 亞硝基硫醇（SNO）含量測定。參照黃雅婷等[16]方法，精確稱取4.00 g白樺懸浮細胞置于預冷研缽中，加入6? mL 0.1 mol/L pH 7.2的Tris-HCl緩沖液，充分研磨后，4 ℃ 10 000 r/min 離心15 min，分別取2? mL上清液于2個離心管中，試驗組加1? mL試劑Ⅲ 40 ℃水浴避光反應5 min;對照組加入1 mL 試劑 Ⅰ 40 ℃水浴避光反應5 min，試驗組和對照組再同時加入1? mL試劑 Ⅱ 40 ℃水浴避光反應5 min，測定540 nm 處吸光度。

2 結果與分析

2.1 白樺酯醇對白樺懸浮細胞生長的影響

將0.1、0.5、1.0和5.0 μmol/L白樺酯醇分別添加到培養7 d的白樺懸浮培養體系中處理12 h、7 d和14 d，其外觀表型如圖1所示，白樺懸浮細胞的顏色隨著培養時間的增加由淺綠色變為翠綠色最后變為淺黃色，其固液比例也基本相同;TTC法分析白樺懸浮細胞活力如圖2所示，不同濃度的白樺酯醇處理與同期對照基本相同且無顯著差異，在處理的第7天時細胞活力達最大值，為1.64～1.69;白樺懸浮細胞的鮮重隨著處理時間的增加呈現增加趨勢，在處理的第14天時達最大值，為38.8～40.1;不同濃度的白樺酯醇處理與對照之間鮮重無顯著差異（圖3）。

2.2 白樺酯醇對白樺懸浮細胞培養液pH和電導率的影響

從不同濃度的白樺酯醇處理后白樺懸浮細胞培養液pH變化（圖4A）可以看出，隨著處理時間的延長pH呈增加趨勢，在處理的第14天達最大值，為11.1～12.1，同期處理與對照之間無顯著差異;如圖4B所示，電導率隨著白樺酯醇處理時間的延長呈現降低趨勢，在白樺酯醇處理的第14天達最小值，為35.2～38.1，同期處理與對照之間也無顯著差異。上述結果表明白樺酯醇對細胞培養液pH和電導率未產生影響。

2.3 白樺酯醇對白樺懸浮細胞中MDA含量的影響

TBA法分析白樺懸浮細胞中MDA含量結果如圖5所示，不同濃度的白樺酯醇處理14 d時，白樺懸浮細胞中MDA含量平均比處理12 h和7 d時分別高出104.25%和103.19%。

2.4 白樺酯醇對SOD和POD活性及其基因表達的影響

從圖6可以看出，

不同濃度的白樺酯醇處理下白樺懸浮細胞中SOD活性及其基因表達基本呈現增加趨勢，其中處理14 d時白樺懸浮細胞中SOD活性及其基因表達平均比處理12 h分別增加了148.29%、352.19%。不同濃度的白樺酯醇處理下白樺懸浮細胞中POD活性及其基因表達變化趨勢與SOD基本相似，但變化幅度不同;白樺酯醇處理14 d時白樺懸浮細胞中POD活性及其基因表達平均比處理12 h分別增加了136.25%和393.96%。

2.5 白樺酯醇處理對白樺懸浮細胞中NO和SNO含量的影響

從不同濃度白樺酯醇處理白樺懸浮細胞7 d后細胞培養液中NO含量（圖7A）可以看出，0.1和0.5 μmol/L白樺酯醇處理下NO含量與同期對照相比無顯著差異，1.0和5.0 μmol/L 白樺酯醇處理下NO含量顯著增加，分別比同期對照增加了159.87%和178.95%。SNO是NO與含巰基的硫醇結合形成的，生物體內SNO含量很大程度上代表著體內結

合態NO含量。不同濃度白樺酯醇處理下白樺懸浮細胞中SNO含量無顯著差異（圖7B）。

3 討論與結論

次生代謝物是植物長期適應生態環境的結果，在植物受到外界刺激引起過敏反應時，次生代謝物會累積增強自身抵抗力。此外，它還可以影響自身或鄰近植物的生長發育[17]，如人參皂苷粗提液對西洋參早期生長產生抑制作用;鼠尾草葉片中的揮發性萜類物質會導致黃瓜根尖細胞中脂質小體的積累、線粒體等細胞器數目下降以及細胞器外膜的破裂;倍半萜內酯混合物銀膠菊堿在低濃度下抑制其幼苗的生長[18-20]。但是次生代謝物影響自身或鄰近植物生長發育的機制還未完全揭示，尤其從細胞水平上。

白樺酯醇室溫下微溶于水，易溶于乙醇等有機溶劑[21]。白樺懸浮培養液不同于普通自來水，它里面不僅添加細胞生長所需營養成分，還有細胞自身培養過程中分泌或代謝的一些物質。為了確定白樺酯醇的最大溶解濃度，該研究通過向培養第7天的白樺懸浮細胞培養液中不斷添加白樺酯醇，以能溶解且培養1 d后不再析出為標準，確定其最大溶解濃度為5.0 μmol/L。因此，該研究將0.1～5.0 μmol/L白樺酯醇分別添加到培養7 d的白樺懸浮細胞培養體系中解析其對白樺懸浮細胞生長生理的影響。

范桂枝等[22]研究發現，在 1 個培養周期內（24 d），白樺懸浮細胞培養過程中三萜的產量與細胞生物量是相偶聯的，隨著生物量的增加三萜產量呈增長趨勢。白樺懸浮細胞在第 12天比生長速率達到最高，三萜合成速率和比合成速率在第 9天達到最高值。鑒于此，該試驗將白樺酯醇添加時間選在其累積高峰前期添加。研究發現，0.1～5.0 μmol/L白樺酯醇處理12 h～14 d，白樺懸浮細胞的外觀顏色、細胞活力和鮮重以及培養液的pH和電導率與同期對照相比均無顯著差異。由此推斷，0.1～5.0 μmol/L白樺酯醇對白樺懸浮細胞的生長不產生影響。

在正常生長發育和應激條件下，活性氧（ROS）均會在植物細胞的線粒體和葉綠體等細胞器中產生[23-24]，ROS 包括單線態氧（1O2）、超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2 ）和羥基自由基（·OH）。過量的 ROS對細胞有很強的毒害作用，它會打破細胞內氧化還原平衡;而適量的ROS對植物生長代謝是有利的，可作為關鍵信號分子激活第二信使、轉錄因子和改變酶活性來調控植物的生長發育[25-26]。SOD能夠催化O2-歧化生成O2和H2O2，POD將H2O2 還原為H2O，二者均是植物體內的保護酶;MDA是膜質過氧化的最終分解產物，其含量可以反映植物受傷害的程度[27-28]。該試驗考察白樺酯醇處理下上述指標發現，白樺酯醇處理下MDA含量、SOD和POD活性及其基因表達水平基本呈增加趨勢，且與同期對照相比存在顯著差異。由此可見，白樺酯醇對白樺懸浮細胞中ROS水平產生了影響。由于白樺酯醇添加后SOD等活性增加，可以推斷白樺酯醇可以提高白樺懸浮細胞的抗氧化能力，并且它對白樺懸浮細胞活力未產生負面影響。

NO是植物體內具有信號轉導作用和生物活性的分子，同時NO可以改變次生代謝途徑中催化酶的活力或者活化次生代謝途徑中特定酶基因，從而提高次生代謝物產量。如NO促進了黃岑苷、金絲桃素和葛根素在懸浮細胞中的積累[29-31]。同樣，東北林業大學森林生物工程實驗室前期也證實NO可以促進白樺酯醇等三萜的合成[32]。該研究發現，低濃度的白樺酯醇對NO未產生顯著影響，高濃度的白樺酯醇顯著提高了NO含量?？疾霳O在植物體內的次級產物SNO發現，白樺酯醇對SNO產生影響不顯著。綜上推斷，白樺酯醇可以改變白樺懸浮細胞中NO的累積，其促進效應存在濃度關系，而SNO未隨之增加還需進一步探究。

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