1株異養硝化-好氧反硝化神戶腸桿菌的鑒定及脫氮特性

胡丹 何富強 杜全能 王剛 蘭時樂

摘要 [目的]鑒定1株異養硝化-好氧反硝化神戶腸桿菌，明確其脫氮特性。[方法]從養殖池塘底泥中篩選到1株異養硝化-好氧反硝化菌HD-NAH，經形態學觀察、生理生化試驗以及16S rDNA序列分析，鑒定為神戶腸桿菌（Enterobacter kobei）HD-NAH，并研究其脫氮特性。[結果]該菌在以檸檬酸鈉為碳源，C/N為18，初始pH為7，溫度為27 ℃，轉速為190 r/min時，24 h亞硝氮（NO2--N）和總氮（TN）降解率分別為99.98%和89.37%，具有較高的降解效率。菌株在初始pH為7～10，溫度為27～37 ℃，轉速為130～210 r/min時，對NO2--N和TN的降解率均較高，表明該菌株的環境適應性較強。在不同氮源條件下，菌株HD-NAH對氮的去除存在差異，其對TN去除率表現為NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH+4-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N，還存在一定短程異養硝化-好氧反硝化過程。[結論]菌株HD-NAH良好的脫氮特性可為養殖廢水除氮提供可選擇材料。

關鍵詞 神戶腸桿菌HD-NAH;異養硝化;好氧反硝化;脫氮特性

中圖分類號 X172? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）10-0070-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.018

Identification of a Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrifying Bacterium and Its Removal Characteristics of Nitrogen

HU Dan1，2，HE Fu-qiang1，DU Quan-neng3 et al （1.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128; 2.Hunan Institute of Microbiology，Changsha，Hunan 410009; 3.Haida Research Institute of Guangdong Haida Group Co.，Ltd，Guangzhou，Guangdong 511400）

Abstract [Objective]To identify a heterotrophic nitrification-aerobic denitrifying bacterium，and clarify its denitrification characteristics.[Method]A heterotrophic nitrification-aerobic denitrifying bacterium was screened from the sludge of aquaculture pond，was named as HD-NAH.The strain was identified as Enterobacter kobei by morphological observation，physiological and biochemical tests，and 16S rDNA sequence analysis.The removal characteristics of nitrite nitrogen and total nitrogen by HD-NAH were studied.[Result]The results showed that degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen by strain HD-NAH were 99.98% and 89.37% respectively，under the conditions of trisodium citrate as the sole carbon source，C/N 18，pH 7，appropriate culture temperature 27 ℃ and shaking speed 190 r/min.The strain HD-NAH had preferable degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen under pH 7-10，temperature 27-37 ℃，and shaking speed 130-210 r/min，it means that strain HD-NAH has strong environmental adaptability.The degradation rate of nitrite nitrogen and total nitrogen were measured under different nitrogen source，the rate was arranged as：NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH+4-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N.The strain showed a certain short-range heterotrophic nitrification-aerobic denitrification process.[Conclusion]It provided an alternative material for the denitrification of aquaculture wastewater basing on good denitrification characteristics of the strain HD-NAH.

Key words Enterobacter kobei HD-NAH;Heterotrophic nitrification;Aerobic denitrification;Denitrification characteristics

基金項目 湖南省重點研發項目（2016NK2103）;湖南創新型省份建設經費資助項目（2020NK2029）。

作者簡介 胡丹（1989—），女，湖南桃江人，助理工程師，碩士，從事環境重金屬檢測研究。 通信作者，副教授，從事微生物資源利用研究。

收稿日期 2021-07-06

水體氮元素的大量累積會造成水體富營養化和生態失衡等一系列問題，嚴重威脅水生生物的生存和健康，制約我國養殖業的持續發展。在處理水體氮污染過程中，微生物起著重要作用，可通過氨化、硝化和反硝化等過程減少水體中的氮含量，從而達到脫氮目的[1]。傳統認為微生物的硝化和反硝化是2個獨立的過程，直到1984年，Robertson等[2]發現一種能進行異養硝化-好氧反硝化的脫氮副球菌（Paracocci denitrificans），并提出了異養硝化-好氧反硝化的概念。異養硝化-好氧反硝化細菌可在有氧條件下利用有機碳源和有機氮源進行生長，在降低有機物含量的同時，利用自發反應去除水體中有毒的氨氮與亞硝酸鹽氮，且除氮率高、除氮速率快，避免了二次污染，受到廣泛關注[3-5]。

異養硝化-好氧反硝化細菌的發現，為生物脫氮提供了新的研究方向。近年來，許多研究者從自然界分離了諸多異養硝化-好氧反硝化菌并對其脫氮進行了研究，包括假單胞菌（Pseudomonas sp.）[6]、無色桿菌（Achromobacter sp.）[7]、芽孢桿菌（Bacillus sp.）[8]、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）[9]和農桿菌屬（Agrobacterium sp.）[10]等細菌及皺褶念珠菌（Diutina rugosa）[11]等真菌。一些細菌在實際水體的應用中取得了良好效果，如魔鬼弧菌（Vibrio diabolicus）SF16對含鹽廢水的氨氮和總氮去除率分別達到97.14%和73.92%[12]，Acinetobacter sp.T1能夠明顯提高養豬場廢水中的氮去除率[13]。因此，篩選出更多高效除氮的菌種資源，對于利用微生物進行氮污染環境修復有著重要意義。該研究從淡水養殖池塘底泥中分離到1株高效異養硝化-好氧反硝化菌株HD-NAH，經形態學觀察、生理生化試驗并結合16S rDNA序列分析，鑒定為神戶腸桿菌，目前有關該菌用于生物脫氮方面的研究鮮見報道。筆者進一步探討了該菌株異養硝化-好氧反硝化的影響因素，以期為菌株HD-NAH應用于淡水養殖廢水的除氮處理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種分離樣品。采集于湖南省長沙市東湖養殖場池塘底泥，裝于無菌玻璃瓶中，迅速帶回實驗室進行富集培養和菌株分離。

1.1.2 培養基。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH自然。加入2%瓊脂，制成斜面培養基。

反硝化培養基：檸檬酸鈉9.0 g/L，NaNO2 0.6 g/L，Na2HPO4 1.0 g/L，NaH2PO4 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L，1%溴麝香草酚藍（Bromothymol Blue，BTB）1.0 mL/L，瓊脂2%，pH 7.0。基礎脫氮培養基：成分同反硝化培養基，不添加1% BTB和瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的富集與初篩。

稱取10 g池塘底泥于100 mL牛肉膏蛋白胨培養基中，32 ℃ 170 r/min搖床中富集培養72 h后，按10倍稀釋法將富集液稀釋至10-8。分別取最后3個稀釋度的稀釋液0.1 mL涂布于反硝化固體培養基平板上，32 ℃ 恒溫培養箱中培養至長出單菌落后，挑取不同形態的單菌落進行純化并編號。

1.2.2 菌種復篩。

將分離純化的菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨培養基中，32 ℃ 170 r/min條件下振蕩培養24 h后，離心收集菌體，使用基礎脫氮培養基洗滌菌體2次，等體積基礎脫氮培養基懸浮菌體，按1%（V/V）接種量分別接種于基礎脫氮培養基中，32 ℃ 170 r/min條件下振蕩培養48 h后，測定菌株對亞硝氮（NO2--N）的去除率。

1.2.3 菌種鑒定。參照《常見細菌系統鑒定手冊》[14]，對菌株HD-NAH的菌落和菌體形態進行觀察并分析菌株的常規生理生化指標。采用DNA提取試劑盒（SK8257，上海生工生物工程股份有限公司）提取菌株的基因組DNA，通過PCR擴增16S rDNA序列。PCR體系（25 μL）：10×Buffer （Mg2+） 2.5 μL、dNTP 1 μL、Taq酶 0.2 μL、引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′）各0.5 μL、模板0.5 μL，用無菌ddH2O定容至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，循環35次，72 ℃延伸10 min。測序后將16S rDNA序列提交至NCBI，使用Blastn檢索比對，用MEGA 7.0.26軟件的鄰位連接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統發育樹，bootstrap自展1 000次檢驗。

1.2.4 菌株HD-NAH脫氮特性研究。采用單因素試驗法，分別改變基礎脫氮培養基的碳源種類（檸檬酸鈉、碳酸鈉、丁二酸鈉、酒石酸鈉和蔗糖）、C/N（2、6、10、14、18、22）、初始pH（6、7、8、9、10）、溫度（22、27、32、37、42 ℃）、搖床轉速（130、150、170、190、210 r/min）和氮源種類（121.74 mg/L NH4Cl、121.74 mg/L NaNO3、121.74 mg/L NaNO2、60.87 mg/L NH4Cl+60.87 mg/L NaNO3、60.87 mg/L NH4Cl+60.87 mg/L NaNO2），探討不同條件下菌株HD-NAH的脫氮性能。

1.2.5 測定方法。

參照文獻[15]中的方法測定發酵液上清液中氨氮（NH4+-N）、亞硝氮（NO2--N）、硝態氮（NO3--N）和總氮（TN）含量。

1.2.6 數據處理。

使用GraphPad Prism 8.0.1對數據進行處理。采用SPSS 25.0統計軟件對數據進行one-way ANOVA分析和Tukey’s HSD 檢驗（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

從養殖水體底泥中篩選菌種，通過富集和平板分離，共獲得11株具有反硝化能力的菌株，分別命名為HD-NAH、HD-NBH、HD-NCH、HD-NDH、HD-NEH、HD-NFH、HD-NGH、HD-NHH、HD-NJH、HD-NMH、HD-NNH。將分離的11株菌株分別接種至牛肉膏蛋白胨培養基，32 ℃ 170 r/min振蕩培養24 h后，按1%（V/V）的接種量接入基礎發酵培養基中，同樣條件下發酵48 h，測定發酵液中NO2--N含量。從圖1可見，分離篩選的11株細菌均具有NO2--N的降解能力，菌株HD-NAH對NO2--N的去除率最大，達到94.36%。因此，選擇該菌株進行后續研究。

2.2 菌株HD-NAH鑒定

2.2.1 菌株形態觀察。

菌株HD-NAH在反硝化培養基上培養24 h后的菌落形態為圓形，較小，白色，表面濕潤光滑，邊緣整齊，半透明;顯微鏡下細菌形態特征呈短桿狀、無芽孢，周生鞭毛。

2.2.2 生理生化指標。

菌株HD-NAH的半乳糖、V-P反應、硝酸鹽還原、亞硝酸鹽還原發酵為陽性;麥芽糖、MR反應、水解淀粉、吲哚和纖維素水解發酵為陰性（表1）。該菌株的生理生化特征與《常見細菌系統鑒定手冊》[14]中的腸桿菌屬基本一致。

2.2.3 16S rDNA序列及系統發育樹的構建。

使用通用引物27F/1492R對菌株HD-NAH的16S rDNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠檢測PCR產物，在1 500 bp處有明顯條帶（圖2A），長度為1 475 bp。Blast比對分析后采用MEGA 7.0.26軟件對選取的序列進行系統發育樹構建，結果見圖2B。菌株HD-NAH與神戶腸桿菌STW0522-51及Enterobacter kobei strain WCHEK045523的親緣關系最近。結合形態學和生理生化試驗結果，將菌株HD-NAH鑒定為神戶腸桿菌。

2.3 菌株HD-NAH脫氮特性

2.3.1 碳源對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。

從圖3可見，不同碳源對菌株HD-NAH的NO2--N、TN降解率存在顯著影響（P<0.05）。以檸檬酸鈉為碳源時，NO2--N、TN的降解率最高，分別為75.21%和57.23%。因此，選擇檸檬酸鈉為碳源進行后續脫氮特性研究。

2.3.2 C/N對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。

通過改變培養基中碳源的含量，測定了菌株在6種不同C/N條件下的脫氮情況。結果表明（圖4），C/N對菌株脫氮具有顯著影響（P<0.05）。C/N在6～18時，NO2--N、TN的降解率隨著C/N的升高而增加;在C/N為18時，NO2--N、TN的降解率均達到最高，分別為91.56%和66.95%;C/N大于18時，NO2--N、TN的降解率均下降。因此，選擇C/N為18進行后續試驗。

2.3.3 初始pH對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。培養基pH主要影響生物的細胞膜電荷量、細胞膜通透性以及對營養物質的吸收。從圖5可知，菌株在中性和堿性環境（pH≥7）對

NO2--N、TN的降解率明顯高于酸性環境（pH為6）。在pH為7～10時，NO2--N的降解率均超過93.01%。初始pH為7時，NO2--N、TN的降解率最佳，分別為95.66%和79.43%。但當pH高于9時，NO2--N、TN的降解率反而下降。以上結果說明菌株HD-NAH對中性和堿性環境具有較廣的適應性，在pH 7～10對氮具有較高的去除率，因此后續選擇pH為7進行試驗。

2.3.4 培養溫度對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。

溫度主要影響酶促反應速率、細胞膜的流動性和營養物質的離子化程度，從而影響微生物代謝產物的合成。從圖6可見，菌株HD-NAH具有較廣的脫氮溫度適應性，在27～37 ℃時，對NO2--N、TN的降解率無顯著差異（P>0.05），27 ℃為最佳氮去除溫度，NO2--N、TN的降解率分別達到99.95%和84.64%。當溫度低于27 ℃或高于37 ℃時，NO2--N、TN的降解率下降。因此，選擇培養溫度為27 ℃進行后續試驗。

2.3.5 搖床轉速對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。搖床轉速主要影響培養過程的溶氧量。從圖7可見，搖床轉速在130～210 r/min時，菌株對TN的降解率無顯著影響（P>0.05），TN的降解率在81.75%～89.37%;轉速為150～210 r/min時，菌株對NO2--N的降解率也無顯著影響（P>0.05），NO2--N的降解率均超過99.90%;當搖床轉速為190 r/min時，NO2--N、TN的降解率均為最高，分別達99.98%和89.37%。

2.3.6 氮源種類對菌株HD-NAH脫氮特性的影響。

由表2可知，在以NH4+-N為唯一氮源時，NH4+-N的去除率達到87.68%，平均降解速率為4.45 mg/（L·h），TN去除率為70.43%，且NO3--N殘留濃度僅2.90 mg/L。以NO3--N為唯一氮源時，NO3--N的去除率為74.50%，平均除氮速率為3.78 mg/（L·h），TN去除率為69.59%，且NO2--N積累較少，僅5.23 mg/L。以NO2--N為唯一氮源時，NO2--N的去除率為99.84%，平均除氮速率為5.06 mg/（L·h），TN去除率為91.60%，且NO2--N殘留濃度為1.10 mg/L。以NH4+-N+NO3--N為混合氮源，NH4+-N去除率為83.65%，平均除氮速率為2.12 mg/（L·h），NO3--N去除率為96.63%，平均除氮速率為2.45 mg/（L·h），TN去除率為88.45%;以

NH4+-N+NO2--N為混合氮源的條件下，NH4+-N去除率為83.21%，平均除氮速率為2.11 mg/（L·h），NO2--N去除率為96.34%，平均除氮速率為2.44 mg/（L·h），TN去除率為89.29%。以上結果表明，單一氮源時，菌株對NO2--N的去除速率和去除率最高，對NO3--N的去除速率和去除率最低。對TN的去除速率和去除率表現為NO2--N>NH4+-N+NO2--N>NH4+-N+NO3--N>NH4+-N>NO3--N。

3 討論

菌株HD-NAH以檸檬酸鈉為唯一碳源時具有較好的脫氮性能，而以碳酸鈉、丁二酸鈉、酒石酸鈉和蔗糖為碳源時，NO2--N和TN的降解率均很低，這與P.stutzeri HJ-7結果一致，該菌以檸檬酸鈉為唯一碳源時，30 h能去除水體中全部氨氮[16]。但與其他研究中的一些菌株有差異，如P.stutzeri YG-24在以蔗糖為唯一碳源進行反硝化過程中對NO2--N的去除效果最好[17]，P.putida HJH1和Klebsiella oxytoca HJH2以甘油作為唯一碳源時，對NO2--N的降解率最高[18]。可見，碳源種類對菌株的脫氮性能影響較大。

在C/N低于6時，菌株HD-NAH對NO2--N的降解率均很低，這是由于過低的碳源難以為細菌的生存提供足夠的能源，導致其生長緩慢;當C/N在6～18時，菌株除氮率隨C/N升高而上升，但隨C/N繼續增大除氮率反而下降，這是由于過高的C/N會抑制細菌的生長和氮的去除[19]，這與P.chengduensis ADM 2-2 C/N為5～11、P.chloritidismutans ADM 8-1 C/N為5～13[20]的除氮趨勢一致。可見，C/N的高低對菌株的除氮性能影響很大。

酸性環境抑制菌株生長，可能是酸性環境會抑制該菌株功能酶活性和細菌代謝活性，這與Acinetobacter sp.GNR等菌株一致[21]。但菌株HD-NAH在pH為7～9時對NO2--N、TN的去除率分別超過95.0%和79.0%，說明中性和堿性環境有利于該菌株的生長和反硝化作用，即使在pH為10的強堿性環境下，菌株對NO2--N、TN的降解率也能達到93.01%和70.38%，表明該菌株耐堿能力強。

菌株HD-NAH在溫度為27 ℃時的氮降解率最佳，且在27～37 ℃均能高效去除NO2--N、TN，對溫度的適應范圍較廣，這與諸多傳統硝化-反硝化微生物的最適溫度在25～37 ℃一致[22]。

轉速主要影響發酵過程中的溶氧量，溶氧量的高低會影響菌株的生長。該研究菌株HD-NAH在5個轉速條件下除氮率均較高，說明菌株HD-NAH能在較廣的溶氧量范圍進行脫氮，這比一些除氮微生物只能耐受較低的氧濃度有明顯優勢[23]。

氮源種類測試結果表明，菌株HD-NAH有較好的異養硝化-好氧反硝化能力，當環境中

NH4+-N濃度較高時（以NH4+-N為唯一氮源），存在一定NO2--N積累，但NO3--N積累較少，當環境中NH4+-N濃度較低時（以NO3--N或NO2--N為唯一氮源），NO3--N具有一定積累，且NO2--N積累較少，這說明該菌在水中NH4+-N濃度較高時，pH偏堿性，易形成亞硝酸型硝化，在相反的條件下，則形成硝酸型硝化的傾向很大，存在一定短程異養硝化-好氧反硝化過程。

4 結論

從養殖池塘底泥樣品中篩選到1株神戶腸桿菌（Enterobacter kobei）HD-NAH，該菌具有較高NO2--N、TN降解率。菌株HD-NAH去除NO2--N的適宜條件為：碳源為檸檬酸鈉，C/N為18，初始pH為7，溫度為27 ℃，轉速為190 r/min，24 h內對NO2--N、TN降解率分別為99.98%和89.37%。不同氮源條件下，菌株HD-NAH在低NH4+-N濃度中易形成硝酸型硝化，在高NH4+-N濃度中存在一定短程異養硝化-好氧反硝化過程。該研究將獲得的神戶腸桿菌用于水體生物脫氮，至于其在含氮廢水中的實際應用有待進一步研究。

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