十二齒小蠹形態特征及DNA條形碼技術快速鑒定研究

胡淑青 李獻鋒 魏霜 丁鈿

摘要 介紹了我國口岸進口木材中多次截獲的松十二齒小蠹，對該蟲的分類地位、分布、寄主、危害及成蟲形態特征進行了描述。將獲得的該蟲COⅠ序列通過GenBank數據庫比對分析，以及用鄰接法（NJ）構建的系統發育樹，建立了該蟲的DNA條形碼檢測方法，以期為口岸一線的檢測鑒定提供參考。

關鍵詞 十二齒小蠹;分布;形態特征;DNA條形碼

中圖分類號 S41-30? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）10-0119-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.027

Morphological Character and DNA Barcoding Technique Rapid Identification of Ips sexdentatus

HU Shu-qing，LI Xian-feng，WEI Shuang et al （Guangzhou Customs Technology Center，Guangzhou，Guangdong 510623）

Abstract Ips sexdentatus frequently intercepted in imported wood from domestic port was described based on its classification，distribution，host plants，harm，morphological characteristics，etc.COⅠ sequence was blasted with released data in GenBank，and phylogenetic tree based on the Neighbor-Joining Algorithm（NJ） was constructed，and finally DNA barcoding technique indentifying this pest was created，with the hope that it will provide references on inspection and identification of port line.

Key words Ips sexdentatus;Distribution;Morphological characteristics;DNA barcode

作者簡介 胡淑青（1992—），女，廣東廣州人，助理工程師，從事植物檢疫及生物技術研究。通信作者，農藝師，碩士，從事植物檢疫及分子生物學研究。

收稿日期 2021-04-27

十二齒小蠹[Ips sexdentatus（Boerner，1767）]，又名松十二齒小蠹，是古北區林業重要蛀干害蟲，被列入我國林業危險性有害生物名錄，其主要危害松屬、云杉屬植物等針葉樹[1-2]。近年來，我國口岸多次從進境的木材和木質包裝中截獲十二齒小蠹活幼蟲和成蟲。筆者介紹了十二齒小蠹的分類地位、分布、寄主和形態學特征等，并研究了該蟲的DNA條形碼檢測方法，以期為口岸檢疫鑒定提供參考。

1 名稱與分類地位

學名：Ips sexdentatus（Boerner，1767）。

異名：Bostrichus pinastri Bechstein，1818;Bostrichus sexdentatus （Boerner，1776）;Bostrichus stenographus Duftschmidt，1825;Bostrycus pinastri Bechstein;Dermestes sexdentatus Borner;Dermestes sexdentatus Borner，1776;Ips sexdentatus junnanicus Sokanovskii，1959;Ips stenographus （Duftschmidt，1825）;Tomicus sexdentatus （Boerner，1776）;Tomicus stenographus （Duftschmidt，1825）;Tomicus stenographus Duftschmidt。

中文名：十二齒小蠹、松十二齒小蠹。

分類地位：鞘翅目Coleoptera，小蠹科Scolytidae，齒小蠹亞科Ipinae，齒小蠹族（Ipini），齒小蠹屬Ips De Geer[1]。

2 分布

國外主要分布于俄羅斯（遠東及西伯利亞）、白俄羅斯、比利時、土耳其、烏克蘭、南斯拉夫、瑞典、瑞士、塞爾維亞和黑山、斯洛伐克、斯洛文尼亞、愛沙尼亞、奧地利、保加利亞、波蘭、德國、法國、芬蘭、荷蘭、捷克、克羅地亞、拉脫維亞、立陶宛、盧森堡、羅馬尼亞、馬其頓、摩爾多瓦、挪威、葡萄牙、西班牙、希臘、匈牙利、意大利、英國、阿塞拜疆、格魯吉亞、美國、朝鮮、韓國、蒙古、緬甸、日本、泰國、亞美尼亞[3-5]。

國內原發生于黑龍江林區，目前在吉林、遼寧、新疆、內蒙古、陜西、四川、云南等地均有分布[6]。

3 寄主與危害

寄主主要為針葉樹，如高加索冷杉（Abies nordmanniana）、云杉（Picea asperata）、歐洲云杉（Picea excelsa）、魚鱗云杉（Picea jezoensis var.microsperma）、紅皮云杉（Picea koraiensis）、東方云杉（Picea orientalis）、落葉松（Larix gmelinii）、華山松（Pinusarmandii）、高山松（Pinus densata）、思茅松（Pinus kesiya var.langbianensis）、紅松（Pinus koraiensis）、歐洲白皮松（Pinus leucodermis）、黑松（Pinus nigra）、海岸松（Pinus pinaster）、意大利傘松（Pinus pinea）、輻射松（Pinus radiata）、西伯利亞五針松（Pinus sibirica）、歐洲赤松（Pinus sylvestris）、樟子松（Pinussylvestris var.mongolica）、油松（Pinus tabulaeformis）、油松（Pinus tabuliformis）、黃山松（Pinus taiwanensis）、云南松（Pinus yunnanensis）等[3-4]。

主要危害風倒木、火燒木、衰老、生長勢差的衰弱木，是次期性害蟲的先鋒軍[1-2]。陳輝等[7]研究表明，十二齒小蠹是秦嶺華山松的主要次期性小蠹，能迅速入侵衰弱的寄主華山松，利用寄主樹木樹干基部的營養空間。危害嚴重時能直接攻擊健康的活立木，曾在法國中部、西班牙和葡萄牙引起遭受干旱影響的歐洲赤松死亡，并在土耳其的東方云杉上暴發危害[4]。十二齒小蠹危害的坑道狀見圖1。

4 形態特征

雌雄成蟲形態、大小相似，體長 5.8～7.5 mm，褐色至黑褐色，頭部、斜面及側面體被長細毛[3]。觸角膝狀，錘狀部膨大明顯;復眼完整，呈腎形;額面有一橫向隆堤，凸起在兩眼之間，堤基寬厚，堤頂狹窄光亮，呈一字形，橫堤與口上片之間有中隆線與橫堤連成“丁”字。下部刻點細而密，上部刻點粗大疏散。前胸背板無側緣，正面看前圓后方，呈盾形，長約是寬的1.1 倍，全部背板以縱中線為軸，左右對稱，瘤區和刻點區各占背板長度的一半，瘤區中的顆瘤低平微弱，后部顆瘤扁平，形如鱗片。鞘翅長為前胸背板的1.5 倍，為兩翅合寬的1.6倍，溝間部無點無毛;鞘翅斜面每側緣上隆起6個齒，前3齒基闊頂尖，呈錐形，其中第2、3 兩齒略大，第1齒稍小，第4齒粗壯挺拔最大，尖端呈紐扣狀（圖2）[4]。

5 DNA條形碼分子檢測方法

5.1 DNA提取、PCR擴增及序列分析 取3頭成蟲樣品分別用于DNA提取，分3個反應同時進行，提取方法參照Qiagen公司基因組DNA提取試劑盒說明書 （DNeasy Blood & Tissue Kit Cat No./ID：69504）。采用從GenBank數據庫下載的十二齒小蠹COⅠ基因序列（AF113380.1、KP314288.1）設計的特異性引物Ips sex_11：5′-AGATTCTGATTACTTCCACCCT-3′和Ips sex_12：5′-GAGAAACTAAGCCAAATCCTG-3′。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火

30 s，72 ℃延伸2 min，循環30次;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，將正確條帶的PCR產物送上海生工（Sanggon）進行正反雙向測序。測序結果采用SeqMan軟件進行序列校對和拼接，去除兩端引物序列，獲得長度為855 bp的COⅠ條形碼序列（圖 3）。

將序列在GenBank數據庫中進行相似性比對分析，依據相似性的高低和形態近似種屬，將十二齒小蠹、北海齒小蠹（I.amitinus）、 波若混齒小蠹（I.perroti）、刺形齒小蠹 （I.spini-fer）、大體齒小蠹（I.emarginatus）、短喙齒小蠹（I.avulsus）、高山齒小蠹（I.montanus）、混點齒小蠹（I.confusus）、間隔齒小蠹（I.integer）、攪擾齒小蠹（I.perturbatus）、刻紋齒小蠹（I.plas-

tographus）、落葉松齒小蠹（I.cembrae）、美雕齒小蠹（I.cal-ligraphus）、木齒小蠹（I.woodi）、似混齒小蠹（I.paraconfusus）、西南間隔齒小蠹（I.knausi）和亞利桑那齒小蠹（I.lecontei）18種齒小蠹屬COⅠ序列片段下載保存。將所有序列用Clustal X1.83軟件進行序列比對，并轉換成FASTA格式，再利用MEGA 6.0軟件計算各物種間的遺傳距離，并基于鄰接法（NJ）構建系統發育樹。系統發育樹各分支置信區間（bootstrap）均進行1 000次重復檢驗，以此確定待鑒定昆蟲種類。

5.2 結果分析

通過Clustal X1.83軟件比對分析上述所得的COⅠ序列，發現3頭測試樣品的序列完全一致。將COⅠ序列上傳至GenBank中進行“Blastn”相似性檢索，結果發現該序列與序列號為KX035215.1十二齒小蠹線粒體基因序列相似度達99%，覆蓋率達97%;與AF113380.1的十二齒小蠹COⅠ序列相似度達99%，覆蓋率達89%。在NCBI上下載15種齒小蠹屬COⅠ基因序列，并以歐洲榆小蠹（Scolytus multistriatus（KU91237.1））為外群，應用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹，發現待測鑒定昆蟲與十二齒小蠹聚為同一分支，其置信度為99%，且與其他齒小蠹屬明顯分開（圖4）。GenBank比對結果、構建的系統發育樹與形態學分類結果都一致，因此可以判定待鑒定昆蟲為十二齒小蠹。所得的COⅠ序列已上傳至GenBank數據庫，序列登記號為MH260900。

6 討論

小蠹科是重要的森林蛀干害蟲之一，其成蟲和幼蟲蛀食樹皮或木質部，危害極其隱蔽，被認為是通過國際貿易傳播最為普遍的一類昆蟲，也是口岸截獲最為普遍的類群之一。我國口岸截獲小蠹的分類鑒定主要是依靠傳統的形態學分類技術，然而小蠹個體較小，有許多近似種之間形態特征差異甚微，因此，鑒定人員應當具備較高的昆蟲分類知識水平和顯微鏡操作技術。此外，口岸截獲的小蠹蟲很大部分為幼蟲，難于在實驗室條件下飼養成成蟲，僅依靠幼蟲的特征來判定該蟲種類非常困難，這進一步加大口岸對截獲小蠹蟲分類鑒定的難度。

近年來，昆蟲DNA條形碼技術已廣泛應用于種類分子鑒定，成為昆蟲分類形態鑒定的重要補充手段。目前，DNA條形碼技術已在鱗翅目[8]、半翅目[9]、雙翅目[10-11]、膜翅目[12]、鞘翅目[13]、蜉蝣目[14]、彈尾目[15]、直翅目[16-17]和蜻蜓目[18]等中被證實可以進行物種分類鑒定。此外，Greenstone 等[19]通過對步甲科Carabidae 的卵、幼蟲、蛹與成蟲COⅠ序列比較研究，認為可以對未成熟步甲進行種間鑒定;Mitchell等[20]結合DNA條形碼技術和形態學分類，成功對澳大利亞堅果植物上的外侵害蟲小蠹蟲亞科的不成熟階段進行分類研究，顯示了DNA條形碼技術在昆蟲卵、幼蟲鑒定時具有的優越性。常虹等[21]采用小蠹科通用引物和小蠹科COⅠ序列設計引物進行巢式PCR，獲得包括十二齒小蠹在內的11種齒小蠹屬的COⅠ序列。該研究在形態學特征的基礎上，結合DNA條形碼技術，設計1對特異性COⅠ引物獲得COⅠ序列，成功鑒定了待鑒定昆蟲，此方法更為簡單、快速、準確。

目前，十二齒小蠹并未被列為我國重點關注的檢疫性有害生物名錄，但該蟲僅在我國的幾個省區有分布，且該蟲是全國口岸截獲頻率較高的小蠹種類之一，據動植物檢疫信息資源共享服務平臺統計全國口岸于2010—2021年共截獲181次，分別從烏克蘭、阿根廷、加蓬、法國、立陶宛、美國、德國、菲律賓、加拿大、愛沙尼亞、澳大利亞和英國等國家截獲。其成蟲、幼蟲均可造成危害，且寄主是我國常見松屬、云杉屬植物等針葉樹，分布遍及全國，因此該蟲極易在我國找到適宜的生活環境，對我國林業造成嚴重威脅。因此，建議各監管部門應加強對該蟲的檢疫力度，研究針對該蟲的檢疫處理措施，防止其進一步擴散。

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