番茄黃化曲葉病毒和番茄褪綠病毒復合侵染的分子鑒定

楊淑珂 孫紅煒 李凡 徐曉輝 路興波

摘要 以番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus， TYLCV）及番茄褪綠病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）為對象，用分子檢測方法對山東、安徽2省病原進行鑒定。選取山東、安徽2省7個地區，對2種病毒病進行田間調查，采集疑似樣品擴增序列，對其進行同源性比對和遺傳進化樹等分析，進一步了解山東、安徽2個省蔬菜產區2種病毒病的發生情況。結果表明，YLCV在山東省大部及安徽省局部地區已經發生擴散且中國所有的分離物仍屬于IL株系。明確了ToCV在安徽地區發生，且統計發現2個省6個地區ToCV、TYLCV存在單獨侵染及復合侵染。ToCV分離物均可分為2個大組，其中該研究所得到的分離物均與中國其他地區的分離物聚類到一組。

關鍵詞 番茄曲葉病毒;番茄褪綠病毒;分子鑒定;復合侵染

中圖分類號 S436.412.1? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）10-0123-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.028

Molecular Identification of Tomato Yellow Leaf Curl Virus and Tomato Chlorosis Virus

YANG Shu-ke， SUN? Hong-wei，LI Fan et al （Shangdong Academy of Agricultural Sciences， Jinan， Shandong? 250100）

Abstract Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV） and tomato chlorosis virus （ToCV） were identified by molecular detection in Shandong and Anhui Provinces. Seven regions of Shandong and Anhui provinces were selected for field investigation of two kinds of virus diseases， and the amplified sequences of suspected samples were collected for homology comparison and genetic evolutionary tree analysis， so as to further understand the occurrence of two kinds of virus diseases in vegetable producing areas of Shandong and Anhui Provinces. The results showed that TYLCV had spread in most of Shandong Province and some parts of Anhui Province， and all isolates in China still belonged to IL strains. It was clear that ToCV occured? in Anhui， and statistics showed that there were separate infection and compound infection of ToCV? and TYLCV in 6 areas of 2 Provinces. ToCV isolates could be divided into two groups， and the isolates obtained in this study were clustered into group I with those from other regions in China.

Key words TYLCV;ToCV;Molecular identification;Co-infection

基金項目

山東省2013年度農業重大應用技術創新課題“番茄黃化曲葉病毒病防控關鍵技術研究與應用”。

作者簡介 楊淑珂（1986—），女，山東濟寧人，助理研究員，碩士，從事植物病理及轉基因環境安全評價研究。通信作者，研究員，博士，從事植病及轉基因環境安全評價研究。

收稿日期 2021-08-03

番茄黃化曲葉病（tomato yellow leaf curldisease，TYLCD）是目前番茄生產中較為常見且危害較廣的病毒病害之一，首次見于以色列[1]。染病后番茄植株發生矮化，生長遲緩或停滯，頂部葉片褪綠發黃、增厚、變小、皺縮，可發生于番茄幼苗、開花、結果等各個生長期，一旦感病，迅速擴散，不但影響番茄品質而且導致番茄減產，若早期感染甚至絕產[2]。該病毒最早發現于以色列，如今已在全球40多個國家和地區暴發，自20世紀90年代以來，由東向西、自南向北迅速在全國范圍內蔓延，先后在廣東、廣西、浙江、上海、江蘇、四川、安徽、山東、河北、天津、北京、吉林等20多個產區發生[3-6]。尤其對我國南方露地和北方秋延遲保護地番茄生產造成極重大的損失。番茄褪綠病毒隸屬長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），最早發現于佛羅里達州北部溫室的番茄植株上[7]，ToCV的基因組為二分體爭議單鏈RNA（+sRNA），5’端可能有一個甲基化帽子結構，而3’端沒有Ploy（A）結構，也不形成tRNA樣結構，可能會形成發卡結構。病毒粒子長800～850 nm，為彎曲長線形，呈螺旋對稱結構[8]，基因組RNA1和RNA2分別包裝在2種不同的病毒粒子中，對成功侵染寄主都是必須的[9]。番茄褪綠病毒RNA1長8 594 bp，包含4個開放閱讀框（ORFs）;RNA2長8 242 bp，包含9個ORFs，其特征是含有與HSP70熱激蛋白同源的編碼區及重復的外殼蛋白基因[10]。ToCV引發的癥狀與缺素癥極為相似，褪綠黃化癥狀首先自葉片中下部出現并逐漸向上發展，植株中部葉片葉脈間呈輕微褪綠黃化，而底部葉片則會出現明顯的葉片褪綠黃化，葉脈深綠，老葉較新葉褪綠黃化癥狀更為明顯，感病葉片變脆且易折[11]。

筆者以番茄黃化曲葉病毒及番茄褪綠病毒為對象，用分子檢測等鑒定方法對山東及安徽2個省共7個地區的設施番茄疑似病株進行病原鑒定，以期進一步了解山東及安徽2個省2種病毒病復合侵染的發生和蔓延情況，為針對2種病毒病的防控提供預警。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 采集設施番茄疑似病毒樣品共110份，其中采集自山東省番茄樣品84份（山東濟南歷城區16份，山東濟南濟陽縣16份，山東煙臺萊州市20份，山東青島平度市20份，山東濰坊壽光市12份），采集自安徽番茄樣品26份（安徽淮北睢縣18份，安徽淮南8份）。

1.2 番茄黃化曲葉病毒DNA的檢測 采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根公司，DP305）提取樣品植株總DNA。使用簡并引物（Degenerate Primers）PA/PB[12]和TYLCD特異性引物（表1）進行PCR擴增。PCR體系：Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2.0 μL，10× PCR Buffer 2.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR程序：94 ℃預變性 4 min;94 ℃變性 40 s，54 ℃/58.7 ℃退火1.0 min，72 ℃延伸3 min，30次循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物純化回收送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 番茄褪綠病毒的檢測與鑒定

樣品植株總RNA采用總RNA提取試劑盒（天根公司，DP419）進行提取。以提取的總RNA為模板，以3’端引物（下游引物）進行反轉錄，反應體系：模板RNA/引物的變性溶液 6.00 μL，5×M-MLVBuffer 2.00 μL，dNTP Mixture 0.50 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL） 0.25 μL，RTaseM-MLV 0.25 μL，加RNase free dH2O至10 μL。反轉錄完成后-80 ℃保存。參照特異引物ToCV-F/ R[13]及Hirota等[14]的ToCV HSP70的2對特異性引物HSP1-F/HSP1-R和HSP2-F/HSP2-R（表2）進行PCR擴增。PCR反應體系：cDNA 1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，LA Taq酶（5 U/μL） 0.2 μL，10×LA PCR 反應緩沖液（Mg2+） 2.5 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）1.5 μL，加ddH2O至終體積為25 μL，PCR程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性40 s，50 ℃/49 ℃/51 ℃退火1.0 min，72 ℃延伸2 min，30次循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 TYLCV在山東省和安徽省個別地區的發生情況 在山東省、安徽省共7個地區，包括濟南歷城區、濟南濟陽縣、濰坊壽光市、青島平度市、煙臺萊州市、安徽淮北市及淮南市的設施番茄種植區，采集到疑似感染TYLCV的番茄植株樣品110份，樣品提取總DNA后檢測結果見表3。利用PA/PB簡并引物及TYLCV特異性引物擴增分別得到大小約535、838 bp的目的條帶（圖1、2）。

依據TYLCV系統進化樹，TYLCV分離物可以分為4組，分別對應IL、IR、Mild、Gez株系[13]，其中該研究的4個分離物和中國所有的分離物一起聚類在IL組（圖3）。

2.2 番茄褪綠病毒在山東省和安徽省個別地區的發生情況

在山東及安徽2個省發現的疑似感染褪綠病毒的番茄植株出現了植株矮小、上部新葉片變小、葉片邊緣褪綠黃化、邊緣卷曲皺縮、下部老葉癥狀不明顯、枝條直立叢生、頂部發病形似菜花的癥狀（圖4）。

對山東省、安徽省共7個地區的設施番茄種植區調查期間，采集到番茄病株樣品110份，提取總RNA后檢測，結果見表4。

利用ToCV CP的特異性引物擴增后，選取不同地區發現的4條大小為750～800 bp的目的條帶（圖5），測序后利用BLAST進行序列比對，結果表明擴增產物核苷酸序列與GenBank 中的ToCV分離物的基因序列相似性最高可達99%，表明這些樣品確系被ToCV感染，4個ToCV分離物CP全長均為774個核苷酸。4個分離物分別命名為1-4、2-2、3-1、3-3。利用HSP70這2對特異引物擴增后分別得到4組大小約為943、911 bp的目的條帶（圖6），分別包含HSP70的

上、下游及其側翼序列，序列測定和拼接后的HSP70全長為1 665 bp，利用BLAST進行序列比對，結果表明擴增產物核苷酸序列與GenBank 中ToCV分離物的HSP70基因序列的相似性最高可達99%，進一步表明這些樣品確系被ToCV感染。

選取NCBI上典型ToCV CP序列，利用DNASTAR Megalign軟件進行核苷酸一致率比對，結果發現2省4個不同地區番茄樣品ToCV CP基因之間序列一致率最高可達99.7%。山東分離物與北京分離物（KC887999）、韓國分離物（KP114528、KP114533、KP114534、KP114537）、日本分離物（AB513443）序列一致率最高可達99.6%;安徽分離物與北京

分離物（KC887999）序列一致率最高可達99.8%。

選取NCBI上典型ToCV HSP70序列，利用DNASTAR Megalign軟件進行核苷酸一致率比對，結果發現2省4個不同地區番茄樣品的ToCV HSP70基因之間序列一致率最高可達99.8%。山東分離物與韓國分離物（KP114528、KP114533、KP114534、KP114537）、日本分離物（AB513443）序列一致率最高可達99.7%;安徽分離物與韓國分離物（KP114528、KP114533、KP114534、KP114537）、日本分離物（AB513443）序列一致率最高可達99.8%。

為了更好地分析其系統進化關系及其分類地位，使用MEGA 4軟件，對國內外不同地區有代表性ToCV的CP及HSP70核苷酸序列構建系統樹，進行分析（圖7、8）。

根據ToCV CP基因構建的系統進化樹，ToCV分離物可分為2組，Ⅰ 組的組內遺傳距離為0.012;Ⅱ 組的組內遺傳距離為0.015，兩組之間的遺傳距離為0.061，組間遺傳距離大于組內遺傳距離。其中4個分離物與中國其他地區的分離物均聚類到I組，且與東亞地區更為相近。

根據ToCV HSP70基因構建的系統進化樹，ToCV分離物可分為2組，Ⅰ 組的組內遺傳距離為0.006;Ⅱ 組的組內遺傳距離為0.005，2組之間的遺傳距離為0.017，組間遺傳距離大于組內遺傳距離。其中4個分離物與中國其他地區的分離物均聚類到I組。

2.3 番茄褪綠病毒與黃化曲葉病毒的復合侵染

統計TYLCV和ToCV在2省7個地區的檢測結果，山東煙臺萊州市只檢測出TYLCV;安徽淮南市未檢出TYLCV和ToCV;其余5個地區均檢出TYLCV和ToCV，并存在2種病毒的單獨侵染和復合侵染（表5）。

3 討論

通過對山東省、安徽省TYLCV發生情況的調查及檢測可知，目前TYLCV在山東省大部及安徽省局部地區已經發生擴散且中國所有的分離物仍屬于IL株系，可能是由于地區間隔較近，存在頻繁的種苗調運和煙粉虱遷徙因素。周瑩等[15]研究認為TYLCV的傳播路徑有2條，分別為廣東和江蘇路線，該研究在山東和安徽發現的TYLCV均屬于江蘇路線。明確了ToCV在安徽地區發生，且統計發現2省6個地區ToCV、TYLCV存在單獨侵染及復合侵染。分別基于ToCV CP和ToCV HSP70構建系統進化樹，結果發現ToCV分離物可分為2個大組，其中該研究所得到的分離物均與中國其他地區的分離物聚類到I組。

通過計算分離物ToCV的CP與HSP70這2個基因的同義突變（dS）和非同義突變（dN）的比率（dN / dS），結果顯示，CP與HSP70基因均處于負向（或凈化）選擇的壓力之下且所承受的壓力不同。

ToCV自2013年中國首次報道以來，相繼在山東、天津、河北、河南、江蘇省均有發現[15-19]，安徽發現的ToCV從分子水平上看與中國其他地區親緣關系較近，而ToCV并不能通過種子傳播，這可能是由于種苗調運或煙粉虱的遷移造成的。研究發現ToCV為韌皮部限制病毒，其寄主范圍較為狹窄，僅能侵染茄科中的番茄、辣椒、普通煙、黃花煙等[8]，傳播方式單一，使得病毒基因承受更多的選擇壓力。

復合侵染是植物病毒病常見的現象，重慶辣椒上即存在CMV和TuMV的復合侵染[20]，TYLCV和ToCV的復合侵染在天津、南京均有報道[17]。產生ToCV與TYLCV復合侵染的原因：一是番茄可能在不同生育期分別被2種病毒侵染;二是由于這2種病毒均由煙粉虱進行傳播，周瑩等[15]發現煙粉虱可以攜帶2種病毒，在煙粉虱取食時，2種病毒可能同時侵染番茄。病毒的復合侵染通常能引起協生現象，會導致病害出現更加嚴重的癥狀，如PVY和PVX在普通煙草上協生可導致煙草壞死[21]。病毒的復合侵染還可以協助病毒克服寄主抗性，如當含有Sw-5的抗番茄斑萎病毒番茄被番茄褪綠病毒和番茄斑萎病毒同時侵染時，番茄褪綠病毒的侵染會導致寄主番茄對番茄斑萎病毒的抗性喪失[22]。ToCV并未發現抗性基因，TYLCV和ToCV復合侵染也可能幫助TY克服抗性基因的限制，這對番茄生產是一個潛在的威脅。ToCV和TYLCV的發生規律相近，防治方法可以相互參照，目前番茄褪綠病毒與番茄黃化曲葉病毒的協同傳播機制及其協生作用仍需要進一步研究。

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