達格列凈改善2型糖尿病小鼠心肌損傷互作分子網絡研究

張 鑫， 桑占發， 于海波， 宋海旭， 梅 竹， 劉 晶， 閆承慧

1.北部戰區總醫院 心血管內科，遼寧 沈陽 110016；2.解放軍32295部隊檢驗病理科，遼寧 遼陽 111000

糖尿病是一種發病率極高的慢性疾病[1]，主要病理分型為Ⅰ型(胰島素依賴型)和Ⅱ型(非胰島素依賴型)糖尿病，前者是由于胰島β細胞失去功能導致胰島素缺乏而引起血糖升高，后者是由于各種因素引起胰島素信號異常、使外周組織對胰島素的敏感性下降而使葡萄糖吸收功能下降或缺失，最終導致血糖升高[2]。目前，由于各種環境因素和長期不良的生活習慣而引起的代謝綜合征進展成為Ⅱ型糖尿病約占全部糖尿病患者的90%以上[3]。無論是Ⅰ型還是Ⅱ型糖尿病，長期持續的高血糖會引起各種并發癥，包括大血管病變(如冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化、心肌病變等)和微血管病變(腎病、視網膜病變、神經病變、肝病變等)。其中，糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種獨立于高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等癥狀的由高血糖和/或高血脂等因素直接引起的心臟疾病，50%以上的糖尿病患者最終死于DCM導致的心力衰竭[4-5]。有效抑制DCM發生和進展是降低糖尿患者病死率的重要手段[6]。達格列凈是SGLT2抑制劑類降糖藥[7]，SGLT2是鈉-葡萄糖協同轉運蛋白，屬于溶質載體家族5(solute carrier family 5，SLC5)，因此SGLT2又稱為SLC5A2，位于近端腎小管S1/S2段的刷狀緣膜上，負責90%以上葡萄糖的重吸收。達格列凈通過抑制腎小管上皮細胞中SGLT2的功能，抑制尿糖吸收，從而降低血糖[7]。目前，有研究報道，達格列凈還具有良好的心腎保護作用[8-9]。但其作用機制尚不明確。本研究應用高脂飲食(high fat diet，HFD)喂養方式建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，并給予達格列凈干預觀察小鼠心功能的改變，進而通過基因組學大數據和生物信息學分析嘗試尋找其作用通路。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究所用實驗動物均為無特定病原體級，C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，并在北部戰區總醫院全軍重點實驗室動物實驗中心飼養。本研究經北部戰區總醫院實驗動物倫理委員會批準認可。

1.2 糖尿病心肌損傷小鼠模型制備 選取20只6～8周齡的C57BL6J雄性小鼠給予HFD(甘油三酯60%)喂養造模。濕度40%～60%，溫度20℃～25℃，晝夜節律為12 h/12 h。飼養所用籠具及相關器材均定期消毒，每周定時更換墊料2次。小鼠定期檢測體質量、心臟超聲和血糖，HFD喂養24周時成模。將成模小鼠隨機分成兩組，達格列凈干預組給予達格列凈10 mg/(kg·d)，HFD單獨喂養組給予正常飲用水，繼續喂養3個月，每個月用心臟超聲監測心功能改變情況。成模后，所有小鼠空腹12 h后用異氟烷行全身麻醉，麻醉成功后用無菌手術器械將各臟器組織取材。

1.3 心臟組織標本的收集 分別收集達格列凈干預組和HFD單獨喂養組小鼠各3只。將小鼠麻醉，采用眼科剪打開胸腔，摘取心臟。應用生理鹽水灌注沖洗后，用滅菌衛生紙吸取組織表面附著的水滴。直接將標本放置于含有2 ml TRIzol試劑的15 ml離心管中保存。

1.4 心臟組織石蠟標本制備 橫軸切取新鮮的心臟組織在生理鹽水中沖洗干凈，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，流水沖洗2 h，分別在梯度酒精中脫水，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明，將組織放在50℃～52℃的石蠟Ⅰ中過夜，再在60℃～62℃的石蠟Ⅱ、Ⅲ中浸泡60 min，恢復到室溫，即得到包埋好的組織蠟塊。

1.5 HE染色 將石蠟切片分別置于二甲苯和梯度酒精中脫蠟后，置于蘇木素中10 min，水洗切片；然后置于鹽酸酒精中分化30 s，氨水中1 min反藍，伊紅染液中7 min，脫水、透明，中性樹膠封片。

1.6 Masson染色 將石蠟切片分別置于二甲苯和梯度酒精中脫蠟后，置于Boucn’s液固定過夜。然后，蘇木素中15 min染核，0.5%鹽酸酒精分化30 s，0.2%氨水反藍30 s，滴加1滴HT151染色15 min，磷酸溶液分化1 min，苯胺藍染色15 min，脫水、透明，中性樹膠封片。

1.7 RNA提取 在含有TRIzol的離心管中將心臟組織剪碎后，勻漿機6 500 r/min，勻漿30 s，將勻漿混合液轉入新的EP管中，加入400 μl三氯甲烷，劇烈混勻后，4℃下12 000 r/min離心 15 min；分離上層水相中的RNA至新的EP管中后，按照 1∶1比例，加入異丙醇。輕微上下顛倒。室溫靜置15 min，4℃下12 000 r/min離心15 min，棄上清；加入1 ml預冷的75%乙醇重懸沉淀；4℃下12 000 r/min離心15 min，小心棄上清；加入適量DEPC水溶解RNA。樣品總RNA利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量并經Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)檢測RNA完整性。

1.8 芯片分析 Agilent Mouse ceRNA Microarray 2019(4×180 K，Design ID：086242)芯片實驗以及6個樣本的數據分析在博淼生物進行。樣本的標記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標準流程。首先，總RNA反轉錄成雙鏈cDNA，再進一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)標記的cRNA。標記好的cRNA和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像。

1.9 統計學方法 采用Feature Extraction軟件(version10.7.1.1，Agilent Technologies)處理原始圖像，提取原始數據。然后對原始數據進行quantile標準化。標準化后的數據進行過濾，用于比較的每組樣本中至少有一組75%的樣本標記為Detected的探針留下進行后續分析。用t檢驗的P值和倍數變化值進行差異基因篩選，篩選的標準為上調或者下調倍數變化值>2.0且P<0.05，同時，對每組差異篩選結果進行散點圖、火山圖(對應有生物學重復的分組)和聚類圖繪制。對差異基因進行GO和KEGG富集分析[10]，以判定差異基因主要影響的生物學功能或者通路。

2 結果

2.1 兩組小鼠心功能損傷改善情況比較 干預3個月后，心功能檢測發現，達格列凈干預組較HFD單獨喂養組小鼠心功能顯著改善。組織病理學分析證實，達格列凈干預組較HFD單獨喂養組小鼠心臟顯著縮小，左心室壁厚度降低。WGA染色證實，達格列凈干預組較HFD單獨喂養組小鼠心肌橫截面積減少。Masson染色證實，達格列凈干預組較HFD單獨喂養組小鼠心肌纖維化程度顯著降低。提示達格列凈可顯著改善小鼠心功能。見圖1。

圖1 兩組小鼠心功能損傷改善情況比較(a.小動物心臟超聲；b.心臟左心室射血分數；c.心臟縮短分數；d.心臟大體病理切片HE、WGA和Masson染色)

2.2 實驗數據變異情況分析 分別提取達格列凈干預組及HFD單獨喂養組各3只小鼠心肌組織的mRNA，進行轉錄組學芯片分析。首先，進行實驗數據的變異情況檢測。本次檢測結果中平均CV值為4.724 7，最大CV值為7.013 4，低于15%的CV值要求，提示芯片實驗成功。

2.3 樣本相關性與主成分分析 應用Pearson Correlation檢驗方法評價樣本間相關性結果。利用基因的表達量進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，觀察樣本的分布情況，對樣本間的關系和實驗設計進行驗證，從不同維度展現樣本間的關系。相關性和PCA提示，兩組樣本主成分差異顯著，各樣本組間具有很好的相關性。見圖2。

圖2 樣本間相關關系與PCA(a.Pearson Correlation檢驗方法評價樣本間相關性；b.樣本PCA)

2.4 差異mRNA表達情況分析 根據分組情況對數據進行過濾并根據對應的閾值(差異倍數>2.0，P<0.05)進行差異篩選，達格列凈干預組小鼠心肌組織中共獲得71個差異表達顯著基因，其中，上調表達23個，下調表達48個。進一步利用火山圖和散點圖進行獲得的差異表達基因的分布情況分析，結果同統計分析熱圖結果一致。見圖3。

圖3 差異表達基因分析(a.差異表達基因分析；b.火山圖分析；c.散點圖分析)

2.5 mRNA差異表達基因的富集通路分析 GO富集分析軟件證實，細胞漿膜蛋白和細胞連接蛋白在兩組心臟組織中存在顯著差異。同時，細胞-細胞連接，漿膜固有成分、I-kB/NF-kB炎癥信號通路和Toll-樣細胞受體通路，是改變較為顯著的細胞生物學信號轉導通路(圖4)。KEGG富集軟件分析發現，炎癥反應通路，Toll-樣細胞受體通路和PPAR通路存在明顯的表達差異(圖5)。兩項分析結果均提示，達格列凈干預可能通過心肌細胞膜受體作用于其抗炎調控通路，發揮改善心功能的作用，而細胞連接信號轉導通路的改變也提示其作用受體有可能是細胞連接受體或分子。

圖4 GO Term分析差異表達基因的細胞學組分、生物學功能和生物活動過程 圖5 KEGG分析差異表達基因主要調控的細胞信號轉導通路

3 討論

本研究應用經典的Ⅱ型糖尿病小鼠模型，闡明了達格列凈在改善Ⅱ型糖尿病引起的心肌損傷和心功能異常中的差異表達基因及其可能的互作調控網絡，這為深入闡明達格列凈干預心肌損傷的作用機制研究奠定了實驗基礎。

本研究結果發現，與HFD單獨喂養組比較，達格列凈干預組小鼠的心臟超聲指標(左心室射血分數和縮短分數)均顯著升高，心肌肥大和心肌纖維化現象也明顯受到抑制，提示達格列凈干預有效的改善了HFD誘導的Ⅱ型糖尿病小鼠的心功能損傷。同時，應用轉錄組學分析顯示，與HFD單獨喂養組比較，達格列凈干預組小鼠心肌組織中共獲得71個差異表達顯著基因，其中，上調表達23個，下調表達48個。并且，通過GO分析和KEGG分析均發現，細胞漿膜蛋白和細胞連接蛋白在兩種細胞中存在顯著差異。同時，細胞-細胞連接，漿膜固有成分、I-kB/NF-kB炎癥信號通路、Toll-樣細胞受體通路和PPAR細胞信號通路，是改變最為顯著的細胞生物學信號轉導通路。達格列凈作為SGLT2受體的小分子抑制劑，主要通過抑制葡萄糖和鈉離子的轉運，改善血糖，減少血容量。但其直接對于心肌細胞保護的作用機制尚不清晰。本研究結果證實，達格列凈干預可能通過其他相關膜受體直接影響了心肌組織的I-kB/NF-kB炎癥信號轉導通路和Toll-樣受體信號轉導通路，從而通過抑制炎癥和免疫細胞調控，改善心肌存活能力，從而改善心功能。

Toll-樣受體可識別不同的病原體相關分子模式，并在先天性免疫應答中發揮重要作用，且在炎癥、免疫細胞調控、細胞存活和增殖方面起著關鍵調控作用[11]。Toll-樣受體信號轉導通路的激活來源于細胞漿Toll/IL-1受體(TIR)的結構域，該結構域與接頭蛋白MyD88發生相互作用。經過配體的刺激，MyD88將IL-1受體相關激酶-4吸引到Toll-樣受體，進一步激活IKK復合體并導致MAP激酶(JNK，p38 MAPK)和NF-κB的激活[12]。PPAR是由脂肪酸及其衍生物激活的核激素受體，屬于核激素受體家族中的配體激活受體[13-14]，同其他核受體超家族一樣，是一類配體依賴的轉錄調節因子，控制許多細胞內的代謝過程，維持代謝穩態和炎癥基因的表達[15]。

綜上所述，達格列凈改善糖尿病心肌損傷是通過抑制炎癥分子和上調Toll樣受體相關的信號轉導通路實現的。進一步通過細胞和動物模型研究進行達格列凈調控研究的驗證，將有希望深入闡明其對心肌細胞保護的調控作用，為更多的保護靶點研究提供有力的實驗研究支持。