阿里牦牛經濟性狀相關遺傳標記基因型頻率研究

張 強,洛桑頓珠,鮮莉莉,平措占堆,索朗多吉,巴 多,旦 巴,旦巴加參,支 張,巴桑旺堆

(1.省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850000；2.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，拉薩 850009；3.西藏阿里地區農業農村局，西藏 阿里 859000；4.西藏阿里改則縣農業農村局，西藏 阿里 859200)

【研究意義】牦牛(Bosgrunniens)廣泛分布于中國青藏高原海拔3000 m以上的地區，其不僅可作為農耕和高原運輸工具，還可以為當地牧民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生產生活必需品，是青藏高原牧民重要的生活和經濟支柱。目前，由于受到不同自然生態條件的自然選擇塑造，我國青藏高原牦牛資源形成了大量適應性強和生產力各具特色的優秀地方資源群體[1]。故而對不同地理分布的牦牛新資源進行種質資源保護狀態評價及遺傳改良評估是提升區域牦牛產業健康發展的重要途徑[2]。【前人研究進展】單核苷酸多態位點(Single nucleotide polymorphism, SNP)作為基因組中分布最廣泛的遺傳變異類型，被廣泛用于物種起源進化、種群遷徙等領域研究。特別是在家養動物育種方面也扮演著重要的角色，如利用全基因組重測序技術對重要經濟性狀的受選擇區域進行候選基因挖掘[3-5]；全基因高密度SNP芯片(DNA chip)用于家養動物經濟性狀全基因組關聯分析進而篩選相關關鍵候選遺傳標記[6-7]。與高成本的全基因組高通量測序技術和微陣列芯片相比，單個重要候選基因的SNP標記與經濟性狀間關聯分析在經濟性狀重要候選基因定位中應用更為廣泛。如，通過單基因SNP關聯分析研究發現在家雞上大量來自MyOD，IGF-I，IGFBP-3，ESM1和Smad3等基因的SNPs與多種屠宰、繁殖和生長性狀相關[8-12]，對黃牛和水牛的研究也發現一系列與生長性狀相關的候選基因，如CDC10[13]，MOGAT1[14]，SPARC[15]，PLAG1[16]，IGF2[17]。另外發現GH和GHR基因與水牛的生長和產奶量相關[18-19]。盡管由于牦牛的生活環境限制而導致針對牦牛的經濟性狀相關候選基因挖掘的研究較少，但仍有一些列與牦牛的經濟性狀相關的候選基因的分子標記被鑒定。如研究發現一個來自MC4R基因的SNP (1069GC)與麥洼牦牛18 月齡體重顯著相關(P<0.01)[20]。位于LPL基因編碼區域中的外顯子7的錯義突變位點SNP(19913CT)與牦牛的體重相關(P<0.01)，平均日增重、腰眼面積和內臟脂肪重量都具有顯著相關性[21]。【本研究切入點】阿里地區位于西藏西部，平均海拔4500 m，有“世界屋脊之屋脊”、“世界第三極”、“生命之禁區”的稱號。當地天然草場數量充沛，是良好的牦牛生產基地，阿里牦牛作為阿里地區特有的牧業資源，牦牛種群數量巨大，為當地牧民提供了肉、奶、役力等重要生產資料。本研究通過對阿里牦牛多種經濟性狀的分析，從而獲得期望的結果。【擬解決的關鍵問題】本研究根據已報道的與牦牛多種經濟性狀具有顯著相關性的候選遺傳標記在西藏阿里牦牛生態類群內優勢基因型分布情況，以期評估種群遺傳改良的潛力。其次，對該群體的遺傳多樣性和群體結構進行評估，為今后牦牛的遺傳資源保護工作提供理論參考。

1 材料與方法

于2020年5月赴阿里地區改則縣牦牛牧場(81°59′86″N；31°30′35″E)收集無血緣關系的青年健康阿里牦牛62頭(年齡為3～5歲)，每只牦牛收集靜脈血液5 mL。利用GNTTM血液DNA提取試劑盒(吉恩生物，中國)提取牛血液全基因組DNA。DNA濃度利用NanoDrop2000DNA微量核酸蛋白測定儀檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量和完整性。

根據位點對應牦牛參考基因組(BosGru_v2.0)序列信息，使用PrimerPlex 2軟件設計PCR反應引物(表1～2)，單堿基延伸引物使用primer3plus(http://www.primer3plus.com/)設計，并交由武漢天一華煜基因科技有限公司(武漢，中國)合成引物。

表1 7個牦牛生長性狀相關SNP標記擴增引物信息

PCR擴增體系：5 μL 2×TaqPCR Mix，上下游引物各0.5 μL，1 μL DNA(20 ng/μL)，3 μL ddH2O補足體系至10 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，循環40次；72 ℃延伸 10 min。SAP消化體系對PCR產物進行純化，詳細步驟如下：使用蝦堿酶純化法將殘余dNTPs去磷酸化，降解游離單鏈引物。取4 μL PCR產物，加入2 μL EX-SAP酶[其中包含ddH2O 0.75 μL，SAP(1 U/μL) 0.5 μL，ExoI(5 U/μL) 0.15 μL，10×SAP buffer 0.6 μL]。孵育程序：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

將混合PCR產物模板純化后進行電泳鑒定，根據濃度定量稀釋。將稀釋后的PCR產物作為模板進行SNaPshot反應。反應體系：SNaPshot Mix 0.5 mL，Pooled PCR Products 3 mL，Pooled Primers 1 mL，ddH2O 0.5 mL，即配制成5.0 mL的反應體系；SNaPshot反應程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，52 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環，4 ℃ 保存。

SNaPshot產物純化體系：直接向SNaPshot反應產物中加入2 μL SAP Mix[包含H2O 0.9 μL，SAP (1 U/μL) 0.5 μL，10×SAP buffer 0.6 μL)]；SNaPshot產物消化反應程序：37 ℃ 40 min，75 ℃ 15 min，4 ℃ 保存。

取2 μL消化后的SNaPshot反應產物加入到含有0.4% LIZ120 8 μL去離子甲酰胺中，95 ℃變性5 min，然后放-20 ℃驟冷，PCR產物由武漢天一華煜基因科技有限公司(武漢，北京)利用ABI3130XL(美國AB應用生物系統公司，美國)完成測序，并利用Genemarker進行SNP位點的基因型判定。

原始分型數據利用Microsatellite Toolkit軟件包計算各遺傳位點及群體的等位基因數(NA)、多態信息含量(PIC)、觀察雜合度(HO)和期望雜合度(HE)等。用Arlequin 3.5軟件[22]進行群體內各位點哈代溫伯格平衡檢驗(HWE)。

2 結果與分析

從表3可知，Hesx1_G618C標記在所在的全部個體中都為純合子G/G型。而來自于相同HesxI基因的另一個標記(Hesx1_T226C)在阿里群體內具有一定多態性，但高頻率為T/T(82.2581%)，等位基因T頻率為91.1300%。另外，ACSL1_A2079T 位點在群體內最高頻率基因型為A/A(67.7419%)，最低為T/T型(3.2258%)，其中等位基因A和T頻率分別為82.2600%和17.7400%。ACSL1_G2409A位點的最高基因型為G/G型(58.0645%)，最低為A/A型(11.2903%)。MyoD1_C1710T位點50%的個體攜帶C/T基因型，C/C 和T/T的頻率僅為25.8065%和24.1935%，其中等位基因C和T的頻率基本相當(C=49.1900%，T=50.8100%)。來自TMEM-18基因的2個位點(TMEM-18_C1267T，TMEM-18_C4447T)在群體內攜帶的最高頻率基因型均為C/C，且T/T為稀有等位基因型(1.6129%～3.2258%)。

表2 7個牦牛生長性狀相關SNP標記單堿基延伸測序引物信息

表3 阿里牦牛群體內7個牦牛生長性狀相關SNP標記基因型頻率及遺傳多樣性信息

由于Hesx1_G618C全部個體都為G/G型，故而其HE、PIC和HO均為0，且無法進行哈代—溫伯格平衡檢驗。剩余位點中HO最高為MyoD1_C1710T(HO=0.5000)和ACSL1_G2409A(HO=0.3065)，最低是TMEM-18_C4447T和TMEM-18_C1267T，均為0.1452。HE值高低排序與HO規律一致，且在群體內各位點的HO和HE間存在分歧，但差距較小。PIC結果顯示，其值分布范圍為0.3749(MyoD1_C1710T)～0.1486(TMEM-18_C4447T和Hesx1_T226C)，即全部位點中僅有2個(MyoD1_C1710T和ACSL1_G2409A)具有中度多態位點(0.25

3 討 論

本研究利用SNaPshot基因分型技術對已明確與牦牛經濟性狀相關的7個候選SNPs標記在阿里牦牛群體內基因型分布開展進行評價，發現阿里牦牛群體攜帶大量重要經濟性狀標記相關標記的優勢基因型。眾所周知，垂體作為性腺軸成員，其在調控多種生長相關激素過程中起了至關重要作用，尤其是垂體前葉分泌的生長激素(Growth hormone, GH)在影響動物生長的作用被廣泛證實[23-24]。研究表明，ES細胞表達同源異型盒基因(Homeobox expressed in ES cells, HesxI)是參與胚胎早期垂體發育的重要基因，影響腎上腺皮質激素和甲狀腺素刺激素分泌[25-27]，尤其是HesxI基因對垂體前葉分泌生長激素具有調控作用[24,28-29]。

在HesxI基因的內含子1區域發現的SNP標記與南陽牛日增重有顯著相關，在外顯子4的突變位點與南陽牛胸圍、6月齡平均日增重、秦川牛的胸圍和體質量等指標都存在顯著相關[30]。在對山羊的研究中，HesxI基因中一些SNP位點被證實與山羊體質量有顯著聯系，且A/A為優勢基因型[31]。尤其是在青海大通牦牛的無角牦牛群體中發現，多個來自HexsI基因的SNPs與其生長性能相關，如HesxI_G-618C與6月齡和12月齡無角牦牛體質量、體高、胸圍均有極顯著相關(P<0.01)，另外，HesxI_T226C與12月齡無角牦牛的體重、體高、胸圍均有顯著相關(P<0. 05)[32]。本研究發現阿里無角牦牛群體中HesxI_G-618C位點為純合G/G型，但在無角牦牛群體內該位點位G/G：76.4000%，G/C:23.6000%。且G/G型為6月齡體質量和胸圍、12月齡體斜長和體質量、18月齡體質量的非優勢基因型[32]。表明HesxI_G-618C位點在阿里牦牛群體內不具備分子遺傳改良與評估價值。另外，盡管約82.0000%阿里牦牛個體攜帶HesxI_T226C位點的T/T型，但仍有17.7419%的個體攜帶T/C型頻率，已有研究表明其與青海無角牦牛12月齡體質量、體高和胸圍的關聯分析研究中確定T/C為優勢基因型[32]，故阿里牦牛在HesxI_T226C位點內具有一定改良潛力。

來自于肌肉調節因子(Muscle Regulatory Factors, MRFS)家族的生肌決定因子(Myostatin 1, MyoD1)是調控骨骼肌生成的重要轉錄因子，它能夠激活肌肉基因轉錄，使非肌細胞轉變為肌細胞，調控肌細胞的融合，促進成肌細胞分化為肌管，進而融合為肌纖維，是調控脊椎動物胚胎期肌肉發育過程的主調控因子[33-34]，同時有研究證實該基因也與壞損組織修復存在密切關聯[34]。在家養動物方面，目前大量在MyoD1基因區域的遺傳變異與家養動物的生長和肉品質經濟性狀呈顯著相關，如篩選獲得MyoD1基因內含子1區的位點突變(T→A)在高郵鴨的49日齡的體重、胸肌重、胸肌橫截面積、胸肌纖維直徑以及胸肌纖維密度均顯著相關(P<0.05)[35]。豬MyoD1基因外顯子4上發現一個同義突變SNP(c.783 GA)與天府黑兔、伊拉兔和香檳兔的全凈膛重、半凈膛重間呈顯著相關(P<0.05)[36]。在長白豬和大白豬的MyoD1基因第1內含子第257位存在1個A/C顛換被證實與肉色評分和失水率相關(P<0.05或P<0.01)[37]。在多個新疆地方綿羊群體中發現MyoD1基因第一外顯子的突變與其產肉性能有關[38-39]。在牛上同樣也發現在MyoD1基因內存在大量與其生長和屠宰性狀相關的遺傳標記[40-41]。尤其，研究發現申扎牦牛MyoD1基因外顯子3上的SNP(MyoD1_C1710T)與體尺性狀顯著(P<0.05)相關，C/T為優勢基因型[42]。本研究發現這個位點優勢基因型在阿里牦牛群體中頻率為50%，暗示利用該標記在此群體內進行分子選育的潛力巨大。

大量研究表明跨膜蛋白18(Transmembrane protein, TEME18)影響癌細胞的代謝和調節[43-44]并參與神經元干細胞的遷移[45]。尤其是近些年研究發現TEME18可通過神經調節而參與脂肪細胞的分化，從而影響機體肥胖[46-47]。通過人的全基因組關聯分析(GWAS)發現TMEM18基因存在與人類食欲及生長發育相關的遺傳變異標記[48-49]。在家養動物中也發現TMEM18基因中多個SNP與豬和牛的多個生長經濟性狀相關[50-51]。尤其是新近在天祝牦牛中發現TMEM18基因SNP標記(C1267T)位點與牦牛的體高、體重和屠宰率差異顯著(P<0.05)。另外，TMEM18_C4447T位點與牦牛的體斜長、管圍、胸圍、體重、胴體重、凈肉重、凈肉率和屠宰率均存在顯著性差異(P<0.05)[52]。本研究發現，兩個來自于TMEM18基因的SNP位點在阿里牦牛群體中都主要攜帶C/T和C/C，而T/T型稀少。據已有研究報道稱TMEM18_C4447T的C/T和C/C較T/T基因型在胸圍、管圍及體斜長指標上均具有優勢，其性能均高于T/T型個體攜帶者[52]。

長鏈酰基輔酶A合成酶1(Long chain acyl-CoA synthetase 1, ACSL1)被證實廣泛參與甘油三酯、磷脂、膽固醇酯的合成及脂肪酸氧化作用[53-55]。眾所周知，鮮乳中最重要指標之一的乳脂，其98%～99%是甘油三酯，主要由甘油和長鏈脂肪酸組成。有研究表明小鼠肝臟細胞及脂肪細胞中過表達ACSL1可增加長鏈脂肪酸轉化為甘油三酯[56]，故而理論上該基因能夠間接提高乳脂率。在家養動物中也發現ACSL1被定位到影響豬(Sus scrofa)肉中脂肪酸組成的QTL區域[57]。另外，有研究發現ACSL1基因多態性與肉牛骨骼肌中脂肪酸組成和比例呈顯著相關[58]。尤其，新近研究發現ACSL1基因區域的大量遺傳變異與荷斯坦奶牛的產奶量的性狀呈顯著相關，包括日產奶量(TDMY)、脂肪含量(FC)、蛋白質含量(PC)和體細胞評分(SCS)[31]。

牦牛上，已有報道稱位于ACSL1基因啟動子區存在2個SNP位點(ACSL1_A2079T和ACSL1_G2409A)并被證實與甘南牦牛的乳蛋白率及總固體物質含量、乳脂率等乳性狀顯著相關，且攜帶ACSL1_A2079T的T/A基因型個體的乳白蛋白率高于A/A型個體，攜帶ACSL1_G2409A位點的A/A型個體乳脂率和總固體含量指標優于其他基因型個體[59]。本研究的阿里牦牛群體中CSL1_A2079T位點攜帶T/A者占總群體的29.0323%，另外阿里牦牛攜帶ACSL1_G2409A位點的A/A基因型個體占種群11.2903%。這表明暗示阿里牦牛群體內具有較高頻率ACSL1基因與產乳性能及乳品質候選標記的優勢基因型。最后，本研究中全部個體均未在阿里牦牛群體內顯著偏離哈代—溫伯格平衡，暗示了阿里牦牛歷史上沒有經歷強烈的人工選擇。

4 結 論

研究結果顯示阿里牦牛群體在與生長及泌乳性狀相關基因的候選標記座位上攜帶高比例優勢基因型，如Hesx1-T226C、MyoD1-C1710T及TMEM-18-C4447T，表明阿里牦牛具有優秀的分子遺傳改良潛力。