枸杞糖肽拮抗環磷酰胺誘導雛雞免疫抑制的作用

王建東，唐玉林，王 敏，張寶所，楊富強，高海慧，于 洋，郭延生

(1.寧夏農林科學院動物科學研究所，銀川 750002； 2.寧夏大學農學院動物科學系，銀川 750021；3.寧夏銀川市婦幼保健院，銀川 750001；4.寧夏順寶現代農業股份有限公司，寧夏 青銅峽 751600)

【研究意義】免疫抑制是指動物機體存在免疫功能障礙，導致免疫力下降，進而更容易受到病原的侵害[1]。目前飼料中禁止添加抗生素已成為養殖業的常態，因此有必要找到一種副作用小且有助于提高畜禽免疫力及生產性能的免疫增強劑，而大量研究表明從植物中提取的多糖具有增強免疫、促生長的作用。【前人研究進展】枸杞子是茄科植物枸杞的成熟果實，在中醫上具有非常重要的地位，李時珍就在《本草綱目》中記載其具有滋腎、潤肺、名目的功效。近年來，枸杞作為藥食兼用的名貴資源受到國內外學者的關注，現代藥理學研究表明枸杞子不僅營養十分豐富而且還具有多種保健功能。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)是枸杞生物活性功能的主要有效成分，具有無耐藥性、無殘留、安全、制造工藝簡單等特點[2]。研究表明LBP具有抗氧化[3-4]、抗炎[5]、神經保護[6]、降血糖血脂[7]、免疫調節[8-9]等功能。LBP可以誘導NK細胞活化，增強NK細胞的細胞毒性，并能夠通過Notch信號誘導樹突狀細胞的表型和功能成熟，并促進樹突狀細胞介導的細胞毒T淋巴細胞活性[10]。張海燕等[11]研究發現，在海蘭褐蛋雞日糧中添加50 mg/kg LBP可顯著提高胸腺和法氏囊的重量，增加血清中白蛋白和溶菌酶含量，促進血液中CD3+T淋巴細胞增殖，由此可見，枸杞多糖具有提高機體免疫功能的臨床功效。而枸杞糖肽(Lyciumbarbarumglycopeptide，LbGp)是從LBP中進一步分離純化后得到的具有更強免疫活性的糖綴合物。【本研究切入點】病原微生物、營養、飼養管理、應激和藥物等因素極易誘發雞群免疫抑制，因此本試驗擬研究通過肌注環磷酰胺(CY)誘導雛雞產生免疫抑制，再通過飲水口服高、中、低劑量的LbGp，以生長狀況、脾臟指數、外周血液淋巴細胞增殖率為評價指標，再輔以脾臟組織學切片分析，旨在探討LbGp對CY誘導產生免疫抑制雞的免疫調節作用。【擬解決的關鍵問題】本研究結果將為進一步研究枸杞糖肽拮抗免疫抑制雛雞的作用機制提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及藥品 1 d齡海蘭蛋雞購自北京市華都峪口禽業有限公司。枸杞糖肽購自于寧夏天仁枸杞生物科技股份有限公司，試驗地點在寧夏順寶現代農業有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 環磷酰胺(貨號：A0505A，大連美侖生物技術有限公司)；雞外周血淋巴細胞分離液試劑盒(貨號：LTS1090C，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)；一次性試驗動物靜脈血樣采集容器枸櫞酸鈉抗凝劑(貨號：TBDTM-0001，天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)；中性福爾馬林固定液(10%NBF)(貨號：G2161，索萊寶公司)；雞外周血淋巴細胞完全培養基(貨號：CM-C007，武漢普諾賽生命科技有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(批號：2012171911，陜西圣奧動物藥業有限公司)；電子秤(型號LT502，上海第二天平儀器廠)自；CO2培養箱購自上海力申科學有限公司；組織切片機(型號：LEICA-RM2235，德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組與處理 將200羽1 d齡海蘭蛋雞，適應性飼養至7 d齡后隨機分成5個組，每組40羽，即空白組(NC)、環磷酰胺組(CY)及LbGp高(LbGpH)、中(LbGpM)、低(LbGpL)3個劑量組，除NC組注射生理鹽水外，其余4組連續3 d肌注80 mg/(kg·d) CY進行造模，造模后LbGp各組連續7 d分別給予10、5、2.5 mg/(kg·d) LbGp。在首次給藥后的第7、14、21和28 天，每組隨機選取5只雞稱重，隨后取下脾臟稱重，記錄數據計算脾臟指數，其公式為：脾臟指數=脾重(g)/體重(g)×100。

1.2.2 淋巴細胞增殖測定 在首次給藥后第7、14、21和28天，每組隨機選取5只雞無菌心臟采血，隨后離心分離淋巴細胞，培養后采用MTT法測定淋巴細胞OD490nm值。

1.2.3 脾臟組織切片 在首次給藥后第7、14、21和28天，每組隨機選取5只雞處死后取脾臟，將其完全放入10%NBF中，室溫保存3 d，按常規操作制備石蠟切片后HE染色并鏡檢。

1.2.4 數據統計 使用SPSS 25.0進行One-way ANOVA檢驗分析各組間的差異顯著性，結果用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 枸杞糖肽對CY免疫抑制雞體重的影響

由表1可知，在第7、14、21和28天，CY組免疫抑制雛雞的體重均低于其余各組。其中第7天時，NC組體重顯著高于LbGpH、LbGpL和CY組(P<0.05)；第14 天時，LbGpM組體重顯著高于CY組和NC組(P<0.05)；第21天時，LbGpM組顯著高于LbGpH，LbGpH顯著高于CY組(P<0.05)，LbGpM極顯著高于LbGpL、CY和NC組(P<0.01)；第27天時，LbGpM組體重顯著高于LbGpH和LbGpL組(P<0.05)，LbGpM極顯著高于CY和NC組(P<0.01)。

表1 枸杞糖肽對雞體重的影響

2.2 枸杞糖肽對CY免疫抑制雞脾臟指數的影響

由表2可知，在第7、14、21和28 天，CY組免疫抑制雛雞的脾臟指數均低于其余各組。第7 天時，NC組顯著高于CY組(P<0.05)；第14、21和28天時，LbGpM組均顯著高于CY組(P<0.05)。

表2 枸杞糖肽對雞脾臟指數的影響

2.3 枸杞糖肽對免疫抑制雞外周血淋巴細胞轉化的影響

由表3可知，在第7、14、21和28 天，CY組免疫抑制雛雞的外周血淋巴細胞OD490 nm值均低于其余各組。其中第7 天時，LbGpM組外周血淋巴細胞OD490 nm值顯著高于CY組(P<0.05)；第14天時，LbGpH、LbGpM和LbGpL組外周血淋巴細胞OD490 nm值均極顯著高于CY組(P<0.01),NC組顯著高于CY組(P<0.05)；第21天時，LbGpH、LbGpM組外周血淋巴細胞OD490 nm值極顯著高于NC與CY組(P<0.01)；第28天時，LbGpH、LbGpM組外周血淋巴細胞OD490 nm值極顯著高于LbGpL、NC和CY組(P<0.01)。

表3 枸杞糖肽對雞外周血淋巴細胞轉化的影響(OD490nm)

2.4 枸杞糖肽對免疫抑制雞脾臟組織切片的影響

如圖1所示，首次給藥后的第7天各組淋巴細胞分布均勻，分組之間無明顯差異(P>0.05)。如圖2所示，第14 天時NC組生發中心個數約為25～30個；CY組生發中心個數約為20個，且生發中心縮小，邊緣區模糊，脾竇增寬；LbGp各組生發中心個數約40～50個，顯著高于NC和CY組(P<0.05)。如圖3所示，第21 天時NC、LbGp各組生發中心個數約為30～40個；CY組生發中心個數約25～30個，顯著低于NC和LbGp各組(P<0.05)，且生發中心縮小、脾竇增寬。如圖4所示，第28 天時各組生發中心個數約為30～40個，分組之間無明顯差異(P>0.05)。

圖1 7 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結構的影響(HE染色，×10)

圖2 14 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結構的影響(HE染色，×10)

圖3 21 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結構的影響(HE染色，×10)

圖4 28 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結構的影響(HE染色，×10)

3 討 論

3.1 CY對雛雞免疫功能的影響

CY是一種烷化劑類藥物，常用于治療自身免疫病和癌癥，具有細胞毒性作用[12-13]，它可以破壞DNA結構，干擾其進行正常復制，并導致細胞死亡[14]。有研究表明，CY能降低T細胞的增殖能力以及減少Th1細胞和Th2細胞分泌細胞因子[15]，長期使用可導致機體出現免疫抑制等嚴重副作用[16]，因此CY常被用來構建免疫抑制模型。楊樹寶等[17]在使用CY進行雛雞免疫抑制造模，CY組雛雞在體重、脾臟指數及外周血淋巴細胞轉化作用等指標上明顯低于正常組。周亞琳等[18]在使用CY誘導小鼠產生免疫抑制，其脾臟組織學病理切片鏡檢可見紅髓和白髓界限不清、脾竇增寬，且出現脾臟淋巴細胞減少的現象。本試驗結果顯示CY組出現生長性能抑制、脾臟指數降低和外周血淋巴細胞轉化減弱現象，并且脾臟組織學切片可見生發中心縮小、邊緣區模糊、脾竇增寬，說明本試驗雛雞免疫抑制構建成功。

3.2 枸杞糖肽對CY免疫抑制雞體重和脾臟指數的影響

體重可直接反映畜禽的生長情況，而脾臟則是畜禽最重要的免疫器官，免疫器官的發育情況能夠直接影響機體的免疫功能[19]，尤其從脾臟衍生的一些巨噬細胞亞群能夠發揮調節免疫系統的作用[20]。因此，通過體重和免疫器官指數可以在一定程度上反映機體的生長性能和免疫功能。而已有研究證明，CY可以明顯減少脾臟淋巴細胞數量進而導致小鼠生長減緩和免疫器官重量明顯降低[21-22]。同時，研究表明LbGp可以改善肉雞的生長性能[23]，可以提高CY誘導產生免疫抑制小鼠的免疫器官指數和減輕免疫器官損傷[24]，LbGp還能夠增加腸通透性和改變腸道組織學結構，抑制嗜中性粒細胞積累，降低TNF-α水平，提高脾臟淋巴細胞增殖率[25]。本研究也發現LbGp具有能提高CY誘導免疫抑制產蛋雛雞的生長性能和脾臟指數的作用，其中LbGp中劑量濃度[5 mg/(kg·d)]效果最好。

3.3 枸杞糖肽對免疫抑制雞外周血淋巴細胞的影響

淋巴細胞是免疫系統的重要組成部分，在防御機體疾病方面發揮著巨大的作用[26]。淋巴細胞的作用是產生針對細菌、病毒、真菌、寄生蟲和有毒化學物質的抗體，殺死入侵生物和感染細胞，并釋放細胞因子以警告其他細胞存在危險[27]。外周血淋巴細胞，是指存在于外周血液循環中的淋巴細胞，能夠引起機體免疫抑制劑量的CY可以導致外周血淋巴細胞數量迅速減少和免疫器官細胞異常凋亡[28]。有研究表明，淋巴細胞轉化率的高低也可在一定程度上反映出機體免疫水平[29]。劉永利等[30]在日糧中添加4 g/kg LbGp可顯著提高肉雞外周血淋巴細胞轉化作用。徐占云等[31]研究發現，在體外培養外周血淋巴細胞液中分別加入4、16、64、256 μg/mL LbGp均能夠促進雛雞淋巴細胞增殖，其中16 μg/mL濃度效果最好。另有研究表明，LbGp可以激活轉錄因子NFAT和AP-1，誘導IL-2和IFN-γ基因的轉錄和蛋白質的產生，并刺激T細胞產生Th1細胞因子，其誘導T淋巴細胞增殖速度為原來的3～4倍[32]。本試驗結果也證明LbGp可以提高產蛋雛雞外周血淋巴細胞轉化作用。

3.4 枸杞糖肽對免疫抑制雞脾臟組織學的影響

生發中心(GC)是在次級淋巴器官中發育的專門的微體系結構，是B細胞增殖、分化和產生高親和力抗體的區域，在體液免疫過程中發揮著重要作用[33]。郝文麗[34]研究發現LbGp可修復亞健康小鼠被破壞的脾臟組織結構形態，顯著增加淋巴細胞數量，說明LbGp可以起到恢復脾臟損傷的作用。本試驗通過對雞脾臟的組織學變化的觀察，發現CY能夠損傷雞脾臟，減少生發中心數量和淋巴細胞數量，而LbGp能夠在一定程度上促進脾臟損傷恢復。

4 結 論

本試驗采用CY誘導雛雞產生免疫抑制狀態，研究LbGp對免疫抑制的拮抗作用，結果表明LbGp可以顯著提高CY誘導產生免疫抑制雛雞的生長性能，顯著促進脾臟的發育，加快脾臟因CY帶來損傷的恢復過程，極顯著提高了CY誘導產生免疫抑制雛雞外周血淋巴細胞的增殖能力，以LbGp中劑量組[5 mg/(kg·d) ]效果最好。