輔酶Q10對冠心病心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡的影響

伊加提·司馬義，帕合熱丁·努爾麥麥提，阿布都乃比·麥麥提艾力

冠心病是指由冠狀動脈血管發生粥樣硬化所引起的血管狹窄、阻塞，從而造成心肌缺血、缺氧甚至壞死的心臟疾病，是臨床上常見的心血管疾病[1]。心肌缺血再灌注損傷是冠心病病人圍術期常見的臨床并發癥之一。心肌缺血再灌注損傷的發生不僅可影響再灌注的治療效果，還可加劇脈管病變，甚至誘發惡性心律失常、心源性猝死，嚴重威脅病人生命安全[2]。輔酶Q10(CoQ10)是一種類似維生素的脂溶性物質，廣泛存在于大多數細胞膜的磷脂雙層的疏水內部[3]。研究顯示，輔酶Q10主要通過增強相關線粒體活性，參與線粒體呼吸鏈作用，在三磷酸腺苷(ATP)合成中扮演著重要角色[4]。另有文獻表明，輔酶Q10還可參與活性氧的清除，發揮脂質過氧化抑制作用，從而參與氧化應激的調節[5]。近年來，隨著臨床研究對CoQ10認識的不斷深入，輔酶Q10被廣泛用于各種心血管疾病的治療，但其在冠心病心肌缺血再灌注損傷中的作用機制尚未闡明。本研究擬構建冠心病大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探究輔酶Q10對冠心病大鼠心肌缺血再灌注損傷時心肌細胞凋亡的影響，進一步明確其對心肌細胞的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只成年無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠，體質量(200±20)g，均購于廣東省動物實驗中心。所有實驗動物均于生物安全實驗室分籠飼養，自由飲食飲水，保持室內安靜、通風，12 h間隔照明，室溫(20±2)℃，相對濕度(50±5)%。所有動物實驗均經倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 輔酶Q10(國藥準字H46020107，海南卓泰)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Invitrogen公司)；實時熒光定量逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR試劑盒(TaKaRa公司)；兔抗鼠β-actin單克隆抗體、兔抗鼠B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體、兔抗鼠天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)單克隆抗體(Abcam公司)；原位末端標記法(TUNEL)試劑盒(美國Roche公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、蛋白上樣緩沖液(中國上海碧云天生物工程研究所)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型構建 采用高脂飲食飼養聯合腹腔注射垂體后葉素構建大鼠冠心病模型：每日高脂飲食連續飼養6周后，間隔24 h給予腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，連續3次。所有實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組、模型+輔酶Q10干預組(CoQ10組)，每組10只。假手術組：常規飲食，不進行冠心病和心肌缺血再灌注損傷造模，于左冠狀動脈前降支行穿線處理，不進行結扎，術后以10 mg/(kg·d)生理鹽水肌肉注射7 d。模型組：在冠心病建模基礎上，于左冠狀動脈前降支行穿線結扎，建立心肌缺血再灌注損傷模型，以結扎線遠端心前壁蒼白色、ST段抬高、T波高聳為缺血成功標志。缺血30 min后松開結扎線，以心肌缺血區恢復紅潤、ST段回落、T波恢復為再灌注成功的標志。術后以10 mg/(kg·d)生理鹽水肌肉注射7 d。CoQ10組：在模型組建模基礎上，術后給予10 mg/(kg·d)輔酶Q10肌肉注射7 d。

1.3.2 電化學發光試劑盒檢測心肌損傷指標 取大鼠左頸動脈血2 mL，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，根據電化學發光試劑盒要求，采用比色法檢測大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等心肌損傷指標表達水平。

1.3.3 蘇木素-伊紅(HE)染色檢測缺血區細胞形態 斷頭法處理實驗大鼠，各組大鼠取適量心肌均勻切成5片，每片厚度約為2.0 mm，置于包埋盒內，浸于4%多聚甲醛中固定過夜。常規乙醇梯度脫水，隨后取出，置于包埋機中2 h進行石蠟包埋。隨后將切片置于二甲苯及梯度乙醇中依次浸泡脫蠟，采用蘇木素染色40 s，1%鹽酸乙醇沖洗后，置于伊紅溶液中染色3 s，隨后使用自來水沖洗。沖洗后將切片置于梯度乙醇及二甲苯溶液中進行脫水和透明處理。隨后使用中性樹脂覆蓋玻片進行封固。于光學顯微鏡下觀察并采集圖片，應用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理并作統計。

1.3.4 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色檢測心肌梗死情況 取大鼠心臟懸掛于離體心臟灌注架上，采用37 ℃ K-H液灌注5 min，重新結扎左冠狀動脈前降支，從主動脈逆行緩慢灌注0.5 mL 0.25%伊文思藍溶液。-80 ℃充分冷凍心臟，從心尖部至結扎處切2 mm厚心肌組織切片，置于1% TTC溶液中，37 ℃恒溫水浴孵育10 min，4%多聚甲醛固定12 h。梗死區呈現白色，缺血區呈現紅色，于光學顯微鏡下觀察并采集圖片，并應用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算心肌梗死面積與體積。

1.3.5 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡指數 將大鼠心肌組織以4%多聚甲醛固定過夜，雙蒸水沖洗、脫水、脫乙醇、透明、石蠟包埋，制備厚度為2～3 μm切片，使用In Situ Cell Death Detection Kit進行TUNEL染色，滴加TUNEL反應液50 μL(enzyme solution及label solution按1∶9配制，即用即配，冰上操作)，保濕、避光、37 ℃下孵育60 min；PBS漂洗后，滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)至完全覆蓋細胞以復染核；再次漂洗后，滴加抗熒光淬滅劑于載玻片上，將爬片倒扣在滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上封片，于光學顯微鏡下觀察凋亡陽性細胞計數，凋亡指數=(視野內凋亡細胞數/視野內所有細胞數)×100%。所有實驗重復3次。

1.3.6 心肌細胞線粒體膜電位檢測 制備大鼠心肌細胞單細胞懸液，取1×105個細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，加入0.5 mL的羅丹明123染色液充分混勻。培養箱常規孵育15 min。4 ℃、1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次。500 μL PBS重懸細胞，使用流式細胞儀測定各組大鼠心肌細胞的線粒體膜電位的變化情況。以Rhodamine 123熒光強度反映線粒體膜電位改變情況。

1.3.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測mRNA表達 采用Trizol法提取大鼠心肌組織細胞總RNA。采用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。參照mRNA反轉錄試劑盒及SYBR?Premix Ex Taq TM試劑盒操作說明進行反轉錄和RT-qPCR檢測，計算相對定量結果。所有試驗重復3次，相對定量分析按照2-[△△Ct(實驗組)-△△CT(對照組)]求出Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達水平。Bax、Bcl-2、Caspase-3引物及內參GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。

1.3.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測蛋白表達 取大鼠心肌組織約50 mg，加入組織蛋白提取液，4 ℃充分碾磨，10 000 r/min離心10 min，取上清液。線粒體蛋白提取采用線粒體蛋白提取試劑盒，心肌細胞蛋白提取使用RIPA裂解液。采用BCA蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量，各組以30～60 μg相同的蛋白上樣量，煮沸變性后進行凝膠電泳，隨后使用半干轉儀轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，抗Bax單克隆抗體(1∶1 000)、抗Bcl-2單克隆抗體(1∶1 000)、抗Caspase-3單克隆抗體(1∶800)4 ℃孵育過夜。PBS-Tween 20液漂洗，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗反應，PBS-Tween 20液洗膜，增強化學發光法(ECL)顯色，凝膠成像儀曝光拍照。檢測各組實驗大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡標志蛋白以及線粒體蛋白p-Cx43表達情況。所有試驗重復3次，灰度值采用Image Pro Plus 6.0軟件檢測分析。

2 結 果

2.1 3組大鼠心肌損傷指標表達水平比較 與假手術組比較，模型組和CoQ10組大鼠血清LDH、CK-MB表達水平均明顯較高(P<0.05)；與模型組比較，CoQ10組大鼠血清LDH及CK-MB表達水平均明顯降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠心肌損傷指標表達水平比較(±s) 單位：U/L

2.2 3組大鼠心肌組織細胞形態比較 光學顯微鏡下觀察可見，假手術組大鼠心肌組織細胞排列相對整齊，細胞核膜完整，核仁清晰可見，無明顯核固縮表現；模型組大鼠心肌組織細胞體積明顯縮小，核固縮明顯，呈深染色表現，細胞水腫明顯，細胞間隙有明顯的細胞浸潤表現，可見明顯的壞死細胞；CoQ10組大鼠心肌組織細胞水腫狀態較模型組有所改善，細胞水腫狀態呈現不同程度減輕，細胞核深染明顯減輕，細胞皺縮明顯緩解，細胞形態基本趨于正常。詳見圖1。

圖1 3組大鼠心肌組織細胞形態比較(HE染色，×40)

2.3 3組大鼠心肌梗死情況比較 與假手術組比較，模型組和CoQ10組大鼠心肌梗死面積及梗死區體積均明顯增大(P<0.05)；模型組大鼠心肌梗死面積、梗死區體積均明顯大于CoQ10組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組大鼠心肌梗死情況比較(±s)

2.4 3組大鼠心肌細胞凋亡指數比較 TUNEL實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組和CoQ10組大鼠TUNEL陽性細胞數、心肌細胞凋亡指數均明顯升高(P<0.05)；模型組大鼠TUNEL陽性細胞數及心肌細胞凋亡指數均明顯高于CoQ10組(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

圖2 TUNEL染色觀察凋亡陽性細胞情況

與假手術組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.5 3組心肌細胞線粒體膜電位比較 與假手術組比較，模型組和CoQ10組心肌細胞熒光強度明顯下降(P<0.05)；與CoQ10組比較，模型組心肌細胞熒光強度下降程度更明顯(P<0.05)。詳見圖4。

圖4 3組大鼠心肌細胞線粒體膜電位比較

2.6 3組大鼠心肌組織線粒體蛋白p-Cx43表達比較 Western Blot實驗顯示，與假手術組比較，模型組和CoQ10組大鼠心肌組織線粒體蛋白p-Cx43表達下調(P<0.05)；其中，CoQ10組大鼠心肌組織線粒體蛋白p-Cx43表達明顯高于模型組(P<0.05)。詳見圖5。

與假手術組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.7 3組大鼠心肌組織凋亡相關蛋白表達情況比較 與假手術組比較，模型組和CoQ10組心肌組織Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，且模型組大鼠心肌組織Bax及Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平高于CoQ10組(P<0.05)。模型組和CoQ10組大鼠心肌組織凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平明顯低于假手術組(P<0.05)，模型組心肌組織Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平低于CoQ10組(P<0.05)。詳見圖6、圖7。

與假手術組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

與假手術組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

3 討 論

冠心病是一類常見的嚴重危害人類健康的心血管系統疾病，其發生與動脈粥樣硬化、血管再狹窄、心肌缺血再灌注損傷等密切相關[6]。心肌缺血再灌注是再灌注治療后心肌損傷加重的病理現象，是影響冠心病病人臨床治療效果的重要原因之一，如何避免或減輕心肌缺血再灌注損傷的發生備受關注。近年來，有文獻指出，心肌細胞凋亡在動脈粥樣硬化和心肌缺血再灌注損傷等心血管系統疾病的發生、發展中扮演著重要角色[7]。近年來，隨著對冠心病發病機制研究的不斷深入，心肌細胞凋亡與冠心病的關系逐漸成為臨床研究的熱點。

輔酶Q10又名泛醌，于1957年被發現，是一種結構類似于維生素K的脂溶性醌，具有抑制細胞凋亡、抗氧化、增強免疫、保護神經系統等作用[8-9]。作為一種強抗氧化劑，輔酶Q10主要參與線粒體呼吸鏈的電子傳遞以及APT的合成，是人類生命不可缺少的重要元素[10]。輔酶Q10在心血管疾病的防治中應用廣泛，作為線粒體氧化磷酸化的關鍵作用因子，輔酶Q10可在線粒體電子傳遞中將復合體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)輔酶Q還原酶傳遞到復合體細胞色素復合物bc1，作為電子傳遞的關鍵組成部分發揮ATP合成限速酶作用[11]。研究指出，心肌組織中輔酶Q10含量豐富，其消耗情況與機體心力衰竭程度密切相關，因而也被稱為心肌細胞能量代謝的激活劑[12]。此外，輔酶Q10還具有高效的抗氧化作用，可通過與氧自由基直接作用，促進氧化型維生素的還原，從而有效避免氧自由基對線粒體DNA和線粒體膜蛋白的損傷[13]。張思潔等[14]的體外實驗研究發現，輔酶Q10可抑制氧化應激條件下心肌細胞中p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化水平，提高心肌細胞存活率，降低細胞凋亡率，下調細胞凋亡蛋白表達，提高細胞中超氧化物歧化酶活性，提示輔酶Q10可抑制氧化應激誘導的心肌細胞損傷。有研究顯示，輔酶Q10可抑制心肌細胞中氧自由基的產生并促進其降解，在心室功能和結構維持中具有保護作用，說明輔酶Q10在心肌細胞的凋亡抑制中具有一定作用[15]。王紅等[16]采用異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌缺血損傷模型，于體內實驗探究輔酶Q10作用，發現輔酶Q10預處理可通過增強 ATPase 活性、增強內源性抗氧化劑活性以及抑制心肌細胞的凋亡等機制在心肌缺血中發揮心臟保護作用，進一步證實輔酶Q10的心肌細胞保護作用。馮慶芝[17]在觀察輔酶Q10治療前后乙醇對兔心臟超聲參數的影響時發現，輔酶Q10可分解過氧化氫(H2O2)，還原過氧化物，通過保護細胞膜結構和功能完整性，逆轉心功能，發揮心肌保護。

除了抗氧化、減少氧化應激、抑制細胞凋亡等生理功能，本研究還關注到輔酶Q10的膜穩定劑作用，鑒于輔酶Q10在線粒體呼吸鏈中的作用，擬通過構建冠心病大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，于體內實驗中驗證輔酶Q10對心肌細胞凋亡的影響，并進一步探究輔酶Q10在線粒體膜穩定性中的作用。LDH和CK-MB是心肌組織損傷的主要標志物，其活性水平與細胞膜結構和功能完整性密切相關。本實驗結果顯示，輔酶Q10干預能改善血清LDH和CK-MB水平，降低心肌損傷標志酶活性，提示輔酶Q10可幫助維持細胞膜完整性和通透性，減輕心肌缺血再灌注引起的心肌損傷。且CoQ10組大鼠心肌梗死面積及梗死區體積明顯小于模型組，TUNEL陽性細胞數、心肌細胞凋亡指數及凋亡蛋白表達明顯低于模型組，進一步從大體標本和細胞水平證實輔酶Q10的心肌保護作用。心肌細胞損傷時線粒體膜電位可明顯下調，為了更進一步探究輔酶Q10發揮心肌保護作用時對線粒體結構和功能的影響，本研究對心肌細胞線粒體膜電位進行了檢測，結果顯示，CoQ10組心肌細胞線粒體膜電位下降幅度明顯小于模型組，且線粒體蛋白p-Cx43表達明顯高于模型組。p-Cx43蛋白與線粒體功能穩定性相關，在線粒體膜通透性、線粒體細胞色素C釋放和鈣離子濃度調節中發揮作用[18]，提示輔酶Q10可在一定程度上維持線粒體穩定性，同時說明輔酶Q10的心肌細胞保護作用可能與p-Cx43蛋白功能有關。

綜上所述，輔酶Q10對冠心病心肌缺血再灌注損傷大鼠具有重要的心肌保護作用，輔酶Q10可通過穩定線粒體膜結構和功能，提高心肌細胞線粒體膜電位，上調心肌細胞線粒體p-Cx43蛋白的表達，抑制心肌細胞凋亡，降低大鼠血清LDH和CK-MB活性，從而縮小心肌梗死面積，改善心功能，發揮心肌保護作用。