零換水條件下復合益生菌對羅非魚生長性能、肌肉品質及養殖水體環境的影響

陳麗婷，吳劍峰，趙玉兵，嚴 欣，肖 俊，羅永巨，項桂德，梁軍能

（1.廣西壯族自治區水產科學研究院/廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室，廣西 南寧 530021；2.廣西諾亞生物科技發展有限公司，廣西 柳州 545000）

【研究意義】我國的水產養殖業正朝集約化方向發展［1］，但高密度養殖帶來的水質惡化、養殖動物免疫力下降、病害頻發等問題，是制約我國集約化養殖高速發展的重要原因［2］。目前精養系統改善水質的辦法通常是直接換水，但這會增加養殖動物的應激，同時給養殖尾水處理及水域環境造成較大壓力。國務院在黨的十八大后提出“全面加強生態環境保護，堅決打好污染防治攻堅戰”的意見，明確提出了建設生態文明的重要舉措。當前，世界各地水產養殖業正蓬勃發展，發展水資源節約型、環境友好型的生態健康養殖，將成為未來養殖業的焦點［3］。因此，開展水資源節約型、生態健康養殖研究，對指導水產養殖業的可持續發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前益生菌在畜牧業和人類健康中的應用已較為廣泛，因其無耐藥性、環保、安全等優點而受到關注，但在水產養殖中應用起步較晚。水質在水產養殖中起到至關重要的作用，在水體中直接添加益生菌，不僅可改善養殖水質，還能改善養殖動物的腸道健康。在養殖水體中添加益生菌用以改善水質、促進養殖動物的健康和生長的方法是目前較推崇的生態養殖方式之一［4-8］。Iribarren 等［9］在水體中添加益生菌后，有效抑制了水體中病原微生物的生長繁殖，改善了水質；李詠梅等［10］在凡納繽對蝦養殖水體中添加益生菌后改善了水質并提高了對蝦的生長性能；徐晨等［11］在生物絮團養殖模式下，養殖水體中添加益生菌能夠促進異育銀鯽的生長；Giatsis 等［12］在羅非魚養殖水體中添加芽孢桿菌7 d 后，其腸道菌群變化顯著；Xia 等［13］在羅非魚水體中添加乳酸乳球菌也產生同樣效果，并且增強了機體對疾病的抵抗能力。在零換水條件下，學者們的研究多集中在添加不同碳源［14-15］，或不同碳氮比所構建的生物絮團系統，對水質［16］及養殖動物的生長、體成分、消化酶［17］以及抗氧化和免疫［18］等的影響，或者在零換水構建的生物絮團條件下，研究不同營養水平對養殖動物生長及營養的貢獻［19-21］，以及研究在零換水條件下添加生物藻土［22］、碳水化合物［23］對養殖池中微生物菌落結構的影響。而在零換水條件下添加益生菌的研究報道較少。唐匯娟等［24］在飼料中添加糖蜜，并在養殖水體中潑灑芽孢桿菌，養殖周期55 d，全程不更換水體，結果表明這種方式在一定程度上改善了羅非魚的生長成活率和生長速率；王淼等［25］等每周潑灑1 次異養硝化細菌，維持10周，結果提高了尼羅羅非魚的抗氧化能力，也維持了池塘水質；孫博超等［26］在凡納濱對蝦發育到蚤狀幼體時開始投喂益生菌，直到發育成仔蝦后5 d 停止，整個過程中不換水，結果表明益生菌組合不僅能夠抑制弧菌繁殖還能提高凡納濱對蝦幼體的成活率。【本研究切入點】上述研究結果表明，添加益生菌能增強魚體的免疫力并且提高生長性能，而在水體中直接添加益生菌還能改善水質，但在零換水條件下添加益生菌的研究鮮有報道，且主要集中在單一菌種的研究上，而單一菌種往往在生態作用中不足以應對復雜多變的養殖水域環境［27］，因此，探討復合益生菌對養殖水質的影響，尋找在零換水條件下適合羅非魚養殖的益生菌組合，對促進羅非魚的健康、生態養殖發展具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】以羅非魚為養殖對象，全池潑灑復合益生菌，以正常更換養殖水的養殖模式為對照，研究添加復合益生菌對羅非魚養殖水質、生長、肌肉品質的影響，以期為促進零水交換條件下的生態、健康養殖技術的發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試羅非魚（Oreochromis mossambicus）規格整齊，體質健壯，個體質量為12.1（±0.5）g，由廣西壯族自治區水產科學研究院國家級廣西南寧羅非魚良種場提供，試驗開始前馴化2 周。商品飼料來源于南寧通威飼料有限公司，粗蛋白含量為36%。復合益生菌由廣西諾亞生物科技發展有限公司提供，該復合益生菌組合包括細黃鏈霉菌、莢膜紅假單胞菌、酵母菌、乳酸菌4 個菌種，活菌含量≥3×109CFU/mL。羅非魚養殖于廣西羅非魚良種場的室內水泥池（長12 m，寬5 m，高1.8 m），水深1.5 m，養殖用水為曝氣自來水。

1.2 試驗方法

試驗處理水體中添加復合益生菌菌液（活菌含量≥3×109CFU/mL），每90 m3水體添加菌液50 mL，試驗開始的首月每隔1 周按相同劑量補充添加1 次菌液，試驗第2 個月開始至試驗結束，每隔1 個月按相同劑量補充添加1 次菌液；以正常更換養殖水的養殖模式為對照，對照不添加益生菌，模擬正常的養殖管理，試驗開始第1、2 個月，每隔2 周更換養殖水體的50%，第3 個月開始到試驗結束，每周更換養殖水體的50%。養殖試驗設3 個重復，一共6 個池，每個池作為1 個處理。

試驗處理和對照的養殖池均使用微孔增氧進行24 h 曝氣后放養羅非魚。試驗開始后，將規格整齊的羅非魚種2 700 尾，隨機分成6 組，每組450 尾，養殖密度7.5 尾/m2。每天投喂2 次（8：00—9：00，17：00—18：00），投喂量按體重的3%計，每15 d 測量魚體質量后調整1 次投喂量。試驗魚經分組后馴養適應1 周，養殖試驗于2020 年6 月18 日開始，至10 月28 日結束，共133 d。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長指標測定 試驗結束后，羅非魚停食24 h，統計成活率及餌料系數；每處理隨機挑選6尾，測量質量、體長，計算增重率、特定生長率。

1.3.2 品質測定 取肌肉測量水分、粗灰分、粗脂肪以及氨基酸。每個處理選取3 尾魚，取每尾魚體一側第3～8 肋骨之間的腹肌約7 g，測定肌肉氨基酸；取魚體另一側第3～8 肋骨背鰭間的肌肉約10 g，測定常規成分。常規成分的水分測定參照GB 5009.3-2010，采用105℃烘箱恒重法；粗脂肪測定參照GB/T 5009.6-2003，采用索氏抽提法；灰分測定參照GB 5009.4-2010，550℃馬弗爐灼燒法；粗蛋白測定參照GB 5009.5-2010，采用凱氏定氮法。氨基酸測定釆用Hetach L-8800 氨基酸自動分析儀，由四川威爾檢測中心測定。

1.3.3 水質分析 試驗第1 天開始采集水樣進行水質檢測，之后每周于9：00 采集1 次直到試驗結束。采樣用對角線方式選擇等距的3 個點，采集上層水，3 個點的水樣混合后現場檢測。溫度和溶解氧使用雷磁便攜式溶氧測定儀（JPB-607A型）檢測，pH、氨氮、亞硝酸鹽采用奧克丹水質分析儀（OCT-B 型）檢測。

1.3.4 生物菌落結構分析 將試驗結束前最后1次采集的水體3 L，利用真空抽濾，水體全部經過0.22 μm 濾膜，將濾膜含菌一面向內折疊后置于無菌EP 管中，在液氮中速凍后，置于5 kg 干冰中包埋后送實驗室進行16S rRNA 高通量測序。

用 CTAB 法提取濾膜中的DNA，PCR 擴增使用Phusion?混合液和保真酶，引物區域為16S V4 區，擴增區域包括16S V3～V4 區。PCR 產物目的條帶利用Qiagen 公司的膠回收試劑盒進行產物回收產物。

使 用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit 和Q-PCR 定量，檢測合格后使用Novaseq PE250 進行上機測序。

利用Qiime 分析工具對測序數據進行質量控制，將一致性為97%的序列進行OTUs 聚類，對出現頻率高的代表序列的物種進行注釋。根據注釋結果，選取每個樣品在門水平最大豐度排名前10 的物種生成物種相對豐度累加的柱形圖；在屬水平上，篩選相對豐度排名前35 的物種繪制成熱圖。用Qiime（Version 1.7.0）計算觀測條數（Observed-species）及α 多樣性指數（Shannon、Simpson、Chao1、ACE、Goods-coverage），采用R 軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線（Rarefaction curve）、等級聚類曲線（Rank abundance）、維恩（Venn）圖。

試驗數據統計使用SPSS 15.0，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan氏法進行多重比較，檢驗組間差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 添加益生菌對羅非魚生長性能的影響

試驗結束時，添加益生菌的試驗處理羅非魚均重為485.32（±0.12）g，對照個體均重為455.93（±31.46）g，試驗處理略高，但差異不顯著；成活率方面，試驗處理的成活率顯著高于對照，而餌料系數顯著低于對照。此外，試驗處理的增重率和特定生長率均高于對照，但差異不顯著（表1）。

表1 添加益生菌對羅非魚生長性能的影響Table 1 Effects of adding probiotics on growth performance of tilapia

2.2 添加益生菌對羅非魚肌肉品質的影響

由表2 可知，試驗處理羅非魚的粗蛋白、粗脂肪水平均顯著高于對照，但差異不顯著；水分和粗灰分與對照相比差異不顯著。由表3 可知，試驗處理羅非魚的肌肉氨基酸總量、必需氨基酸和鮮味氨基酸含量均高于對照，但差異不顯著。

表2 添加益生菌對羅非魚體成分的影響Table 2 Effects of adding probiotics on body composition of tilapia

表3 添加益生菌對羅非魚氨基酸的影響Table 3 Effects of adding probiotics on amino acid of tilapia

2.3 添加益生菌對養殖水體水質的影響

試驗期間，養殖池水溫為26.5～30.5℃，pH為7.0～8.0。試驗處理水體的溶解氧為6.50 mg/L，對照為6.48 mg/L，差異不顯著，而氨氮濃度顯著高于對照，亞硝酸鹽氮濃度顯著低于對照（表4）。

表4 添加益生菌對養殖水體水質的影響Table 4 Effects of adding probiotics on aquaculture water quality

2.4 添加益生菌對養殖水體生物菌落的影響

Goods-coverage 指數表明，本研究測序深度達99%，說明測序基本包含了所有物種。Simpson 指數評估優勢種群的集中程度，值越小，說明群落多樣性越高；Shannon 指數反映群落多樣性，值越大，說明群落多樣性越高［28］，結合Observed-species、Chao1 和ACE 指數可知添加益生菌試驗處理系統中的微生物物種豐富度較高（表5）。

表5 添加益生菌對微生物群落豐富度和多樣性指數的影響Table 5 Effects of adding probiotics on bacterial community richness and diversity index

稀釋曲線主要反映樣品測序數據量的合理性，如果曲線已趨向平坦，說明測序數據量已漸進合理，后續沒有必要進行更多數據量的測序。圖1 顯示試驗處理與對照的稀釋曲線均已趨于平坦，證明所得測序數據量已飽和且測序數據合理，具有代表性，可進一步作數據統計分析。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve

等級聚類曲線可反映測序物種的豐度和均勻度。從水平方向上看，曲線的寬度反映物種的豐富度，曲線在橫坐標軸上跨度越大，代表越高的物種豐度；從垂直方向上看，物種的均勻度由曲線的平滑度反映，物種分布越均勻，則曲線越平緩［29］。由圖2 可見，添加益生菌試驗處理養殖水體的物種豐度大于對照。維恩圖可比較直觀地顯示對照和試驗處理之間共有、特有的OTUs，本研究從試驗處理和對照分別檢出OTUs 數目869、717 個，其中共有的OTUs 數目為557 個，試驗處理特有的OTUs 數目為312 個，對照中特有的OTUs 數目為160 個（圖3）。

圖2 等級聚類曲線Fig.2 Rank abundance curve

圖3 細菌數目的維恩分析Fig.3 Venn analysis of the number of bacteria

由圖4 可知，在細菌門水平上，試驗處理和對照中豐度較高的前10 個門分別為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、梭桿菌門（Fusobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、未分類（Candidatedivision-SRI）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）。其中，試驗處理的優勢菌門（平均相對豐度＞1%）［30］是變形菌門（41.41%）、放線菌門（35.99%）、擬桿菌門（8.28%）、梭桿菌門（5.8%）、疣微菌門（3.4%）；對照的優勢菌門為變形菌門（53.69%）、擬桿菌門（18.40%）、放線菌門（8.05%）、梭桿菌門（5.7%）、疣微菌門（4.9%）、未分類（2.36%）、綠彎菌門（1.39%）。

圖4 生物菌落在門水平上的相對豐度分析Fig.4 Analysis of relative abundance of biological colonies at phylum level

3 討論

3.1 添加益生菌對羅非魚生長的影響

魚類終生生活在水中，水質的好壞對其健康及生長至關重要，保持充足的溶解氧和適宜的pH值是維持水產養殖動物正常生長的基礎。本試驗過程中，添加益生菌的試驗處理和對照養殖水體的溶解氧和pH 值均保持相對穩定，且符合漁業水質標準［31］，為羅非魚的生長提供了有利條件。水體中的亞硝酸鹽氮是主要污染源之一，亞硝酸鹽氮通過影響養殖動物的耗氧、氨氮排泄以及滲透壓等影響機體健康。周鮮嬌等［32］用不同濃度的亞硝酸鹽氮脅迫健康的凡納濱對蝦，結果發現，亞硝酸鹽氮濃度升高，對蝦死亡率隨之增加；黃翔鵠等［33］、吳中華等［34］在研究亞硝酸鹽氮對凡納冰對蝦的毒性實驗中也同樣發現高濃度的亞硝酸鹽氮導致對蝦免疫力下降，由此可見，維持水體中較低濃度的亞硝酸鹽氮水平是保障養殖動物健康的條件之一。本研究中，添加益生菌試驗處理的養殖水體亞硝酸鹽氮顯著低于對照，說明復合益生菌對降低亞硝酸鹽氮方面起積極作用，從而提高羅非魚的成活率，該研究結果與王夢亮等［35］、沈錦玉等［36］的報道相似。養殖水體中添加益生菌后，通過改變水體菌群結構，抑制病原菌生長繁殖，促進有益菌生長，從而增強養殖動物機體的免疫力［37］，吸附霉菌毒素等［38-39］。本試驗中，添加益生菌試驗處理的羅非魚成活率顯著高于對照，認為與添加益生菌的作用效果有關。一般認為，在水體中添加益生菌后，可通過影響腸道功能等促進生長、降低餌料系數［24,40］，光合細菌能夠分泌消化酶如蛋白酶、脂肪酶等幫助消化和吸收，促進營養物質吸收［41-42］，還能夠合成多種維生素和促生長因子［43］，從而提高飼料利用率。本試驗中添加的莢膜紅單胞菌屬于光合細菌，具有類似功能，試驗處理添加該復合益生菌后，羅非魚生長在一定程度上有所提高。細黃鏈霉菌能夠產生木聚糖酶，而木聚糖酶在提高飼料利用率和防止動物結腸炎方面有利［44］。本試驗中，試驗處理的餌料系數顯著低于對照，可能是添加益生菌起到了節約飼料的作用。

3.2 添加益生菌對羅非魚肌肉品質的影響

腸道作為魚體與外界進行物質交換的主要場所之一，腸道微生物數量、群落結構與養殖的水體環境息息相關。王淼等［25］在養殖水體中潑灑復合益生菌改變了羅非魚的腸道菌群結構。研究發現，益生菌進入腸道之后，通過抑制有害菌繁殖，促進有益菌生長，特別是改變厚壁菌門和擬桿菌門的比例，從而影響脂肪沉積，進而改善肌肉風味［45-46］。此外，益生菌還能夠將脂肪氧化成為小分子物質，而腸道菌群中發生代謝反應產生的風味物質能夠轉移到肌肉中，增加肌肉中肌苷酸、脯氨酸、苯丙氨酸等滋味物質［47］，從而提高風味。夏雨等［48］在飼料中添加乳酸菌飼喂凡納濱對蝦，增加了幼蝦肌肉的彈性和咀嚼性。張天陽［49］用150 mL 乳酸菌液飼喂育肥豬時，顯著提高了最長肌的粗蛋白含量，鄔理洋［50］研究發現單獨或混合飼喂微生態制劑、牛膝多糖均可提高育肥豬背最長肌的粗蛋白含量和粗脂肪含量。本試驗中，添加益生菌試驗處理羅非魚的粗蛋白含量顯著高于對照，粗脂肪含量、氨基酸總量、必需氨基酸和鮮味氨基酸含量也高于對照，與上述報道相類似?？梢?，添加益生菌可改變水體的菌群結構，提高水體中有益菌的占比，也能通過影響羅非魚腸道菌群結構的方式，改善羅非魚的肌肉品質。

3.3 添加益生菌對養殖水質及菌群結構的影響

本研究添加的復合益生菌組合包括細黃鏈球菌、莢膜紅假單胞菌和酵母菌和乳酸菌。乳酸菌能改善養殖水質［51］，在水體中通過發揮競爭性抑制的作用，防止有害菌大量繁殖［52］；而且乳酸菌能夠將水體中的大顆粒物質如殘餌、糞便和死藻等通過氧化、氨化、固氮、硝化和反硝化等作用轉化為磷酸鹽、硝酸鹽等物質［53］。莢膜紅假單胞菌是光合細菌的一種，光合細菌被廣泛應用于水產養殖，具有繁殖速度快、生命力強、營養要求低的特點，并且莢膜紅假單胞菌含有天然胡蘿卜素，可作為營養物質［54］。本研究中，添加復合益生菌后，在試驗過程零換水的情況下，開展養殖試驗133 d，與正常換水的對照相比，試驗處理養殖水體的亞硝酸鹽水平顯著低于對照，說明使用益生菌組合能夠有效降解水體中的亞硝酸鹽含量。但在氨氮去除方面，試驗處理養殖水體總的氨氮含量為0.141 mg/L，對照為0.076 mg/L。養殖水體中的氨氮分為離子氨（NH4+）和非離子氨（NH3），非離子氨對魚鰓造成損害，而離子氨則被認為不易造成傷害，兩者的相互轉化受水體中pH 和溫度的影響。漁業水質標準要求非離子氨≤0.04 mg/L［31］。本試驗過程中，養殖水體水溫26.5～30.5℃，pH7.0～8.0，溶解氧6.50 mg/L，均在羅非魚生長適宜范圍內，使得氨氮主要以離子氨的形式存在，并未對養殖魚造成嚴重影響［55］。添加益生菌試驗處理在零換水條件下開展養殖，能夠使養殖水質持續穩定，保持適宜的溫度、pH和溶解氧，并且亞硝酸鹽含量均持續低于更換水質的對照，說明該益生菌組合能夠有效改善養殖水體環境，維持良好且持續穩定的水域生態環境，這可能得益于該益生菌組合能夠有效建立一套完整的生態系統。但試驗過程中，對養殖水體氨氮的去除效果仍不夠理想，后續考慮補充芽孢桿菌等菌株作進一步試驗。

維系養殖水體的動態平衡是生態健康養殖的必要條件，而水體中微生物在促進物質循環和能量流動中起關鍵作用［56］。在養殖水體中添加益生菌后可改善水體菌群的多樣性，可能與益生菌不僅能抑制有害菌生長繁殖，還能在物質循環中起積極作用有關，如分解大分子有機物等，從而改善了水質，促進其他水體有益菌生長繁殖［40］。細菌群落的豐富度和均勻度多采用Simpson 指數，而群落中較為常見的物種數目多樣性則通過Shannon體現，Chaol指數越大，代表物種數量越多，群落豐富度越高。本研究中，添加益生菌試驗處理的Chaol 指數顯著高于對照，Shannon 指數和Simpson 指數與對照無差異，Observed-species、Chao1 和ACE 指數也很好地驗證了這一點，且試驗處理中特有的OTUs 數目遠高于對照。這說明在零換水條件下，添加益生菌組合能夠提高水體細菌菌落的多樣性，為維持有效、穩定的養殖生態環境提供保障。鄭佳佳等［57］在水體中添加復合益生菌改變了水體菌群結構，創造了良好的養殖環境，與本研究結果相似。

本研究中試驗處理和對照的優勢菌門存在一定差異，試驗處理的優勢菌門數量占比94.88%，以變形菌門、放線菌門為主要菌種；對照的優勢菌門數量占比89.84%，以變形菌門、擬桿菌門為主。兩種水體均為養殖水體中較常出現的有益菌種類，未出現弧菌等有害菌群，可能因為添加該復合益生菌后其在養殖水體中更能快速定植，占據有利地位，抑制有害菌生長繁殖，該研究結果與陳景豪等［58］的研究結論相類似。放線菌門、擬桿菌門和變形菌門等具有重要的脫氮功能［59］，在試驗處理養殖水體中占比85.68%，在對照中占比80.14%，且試驗處理中的放線菌數量占比高于對照，說明添加益生菌后改變了原有的菌群結構。放線菌門可通過抗生等競爭性作用占據優勢地位［60］，從而抑制其他有害菌群的生長；變形菌門大部分屬于異養型細菌，在COD 降解和脫氮過程起主要作用［61-62］，變形菌門中最主要的綱為β-變形菌綱，研究表明其與反硝化作用密切相關；擬桿菌門的細菌與DNA、脂類和蛋白質等有機物質的轉換密切相關，在處理廢水過程中發揮重要作用［57］。疣微菌門和綠彎菌門對有機質的降解和硝化發揮重要作用［63-64］。本研究中試驗處理和對照養殖水體中均含有豐富的變形桿菌門、酸桿菌門和擬桿菌門，但在試驗處理養殖水體中優勢更明顯，表明在零換水的條件下添加該益生菌組合，對有機物的轉化利用以及維持水體穩定具有積極作用。

4 結論

本研究針對傳統水產養殖通過頻繁更換水體的方式緩解養殖過程中出現的水質惡化問題，采用添加復合益生菌的方式進行零換水養殖，研究其對水質改善、菌群結構以及羅非魚生長和肌肉品質的影響，結果顯示，添加益生菌組合能夠持續、有效地改善并維持良好、穩定的養殖水環境，養殖全程水溫26.5～30.5℃，pH7.0～8.0，溶解氧6.50 mg/L，亞硝酸鹽0.039 mg/L，均在羅非魚生長適宜范圍內，水體的菌群多樣性提高，節約了換水產生的經濟成本，同時減少了魚類應激，維持機體穩定的生理健康，提高了成活率和肌肉品質，降低了餌料系數。此外，添加益生菌組合能夠做到零換水，有效控制了養殖尾水的排放，為推進節約型和環境友好型的水域環境建設提供了新思路。