微波輔助酶解辣木粕清蛋白制備抗氧化肽及工藝優化

邢君梅，張重權，王有瓊，馬李一

（1.中國林業科學研究院高原林業研究所，云南 昆明 650224；2.南京林業大學化學工程學院，江蘇 南京 210037）

【研究意義】辣木（Moringa oleiferaLam.）為辣木科辣木屬多年生木本植物，具有獨特的藥用和食用價值，主要生長在亞熱帶以及熱帶，其生長速度快、營養價值高、全株可食用，因此是一種經濟價值極高的植物［1］。辣木籽營養價值極高，富含酚類、多糖、油脂、蛋白質、微量元素等，其中辣木籽含油率為28.60%～41.00%，而辣木籽油中不飽和脂肪酸含量超過80.00%，其中油酸含量為62.00%～78.00%，已被使用作為一種高品質的植物油，并且在傳統醫藥中有應治療關節炎，風濕病和高血壓等作用［2-3］。每公頃辣木每年可產辣木籽24 t，提取油后剩余辣木粕14.16～17.13 t，產生大量剩余物［4］。辣木粕中蛋白質含量（32.00%～62.80%）高于辣木籽的蛋白含量（18.60%～37.20%），成為人們消費中重要的植物蛋白補充來源［5-6］。目前這些剩余物主要應用于飼料添加劑［7］，或作為絮凝劑處理工業廢水等［8］。【前人研究進展】研究表明，生物活性肽具有抗氧化、降血壓、抑菌、抗腫瘤和免疫調節等多種生物學功能［9］。生物活性肽通常通過酶水解、微生物發酵或化學水解制備，其中酶解法由于其特異性高，無殘留有機溶劑和毒性的化學物質，已作為食品和制藥行業生產生物活性肽最優選的方法［10］。目前已有研究報道，超聲波輔助辣木粕的乙醇提取物具有抗氧化和抗菌活性［11］。菠蘿蛋白酶將辣木葉經堿提酸沉得到的蛋白質在55 ℃酶解3.64 h，所得酶解物具有抗菌活性和優良的功能［12］；胃蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶將辣木籽經堿提酸沉得到的蛋白質酶解3 h，所得酶解物具有抗高血壓活性［13］；通過水酶法酶解辣木籽蛋白經堿提酸沉得到的蛋白質酶解24 h，可同時提取辣木油和制備抗氧化多肽［14］。目前，大多數研究采用傳統酶解方法酶解辣木葉和辣木籽中的蛋白質，并且測定酶解物的功能活性，而國內外鮮有針對辣木粕中的蛋白質及其酶解產物功能活性方面的研究，也鮮有采用一些特殊的方式輔助酶解，以提高酶解效率、優化酶解工藝方面的研究。【本研究切入點】目前有研究采用超聲波和微波［15］、高靜壓［16］等方法輔助酶解，能夠分離其中的多糖，提高水解度和多肽活性。其中使用最多的方法是微波輔助酶解，但采用的微波儀器功率普遍較大，導致溶液在快速變化的高頻電磁場（微波）作用下快速升溫，且當溫度達到設定溫度后即停止產生微波，只具備保溫效果，使得酶解反應不能在其適宜溫度下保持持續的微波作用，且溫度過高容易導致酶失活。為了解決上述問題，本研究采用低功率微波控制源，將功率控制在0～100 W 之間，能夠較好地將酶解反應控制在適宜的溫度范圍內，低功率下能夠持續產生微波作用，達到較好的酶解效果，縮短酶解時間，極大地提高酶解的效率。采用10 mL 的PE 管，縮小樣品量，使試驗更加方便快捷。【擬解決的關鍵問題】篩選酶解辣木粕清蛋白的最佳蛋白酶，通過單因素和響應面試驗優化酶解條件，進一步通過低功率微波儀器優化，提高酶解效率，以Vc 為陽性對照，測定辣木粕酶解物的抗氧化活性。通過微波輔助酶解制備辣木粕清蛋白制備抗氧化多肽用于化妝品、醫藥、保健食品等行業具有極大的開發潛力和市場價值，使辣木粕資源得到充分有效的利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材：辣木籽采收于云南元陽，元陽屬于云南干熱河谷地帶，氣候高溫、低濕、陽光充足。

試劑：波蘿蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等均購于索來寶公司，牛血清蛋白、1,1-二苯基-2-三硝基苯脫（DPPH）、2,2氣聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）購于Sigma 公司，過硫酸鉀、三氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氫氧化鈉、無水乙醇等均為分析純。

儀器：紫外可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；超純水系統 D11931，Barnstead儀器公司；冷凍干燥系，Heto-Holten 有限公司；全自動酶標儀CERES 900，美國；旋轉蒸發儀，日本東京理化；數顯恒溫水浴鍋，北京永光明醫療儀器廠；低功率微波控制源（0～100 W），云南民族大學；微波反應器，自制，采用RF 射頻座同軸連接器，N型母頭L16 四孔方板法蘭，將法蘭焊接上1.5 mm 直徑的漆包線，并把漆包線螺旋3 圈作為反應器內芯，儀器外采用錫紙包好的鐵盒罩住，防止微波泄漏。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣木粕組分蛋白的提取 將辣木籽脫殼，通過粉碎機粉碎。稱取辣木籽粉100 g，加入石油醚，室溫下冷凝回流8 h，將提完油的辣木粕進行自然風干，過孔徑0.425 mm 的篩，制得辣木粕。采用Osborne 分離分級法提取辣木粕清蛋白、谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白：稱取2.00 g 辣木粕，按料液比1 ∶10 加入10 mL 去離子水，50℃水浴中靜置提取30 min，超聲輔助提取20 min，8 000 r/min 離心20 min，采用考馬斯亮藍法測定上清液中的清蛋白含量；向沉淀加入10 mL 的2%NaCl 溶液，與清蛋白的提取方法相同，采用考馬斯亮藍法測定上清液中的球蛋白含量；再向沉淀加入相同體積的75%乙醇，同上操作，測定上清液中的醇溶蛋白含量；繼續向沉淀加入pH 8.3 的NaOH 溶液，與清蛋白的提取方法相同，測定上清液中的谷蛋白含量。篩選出辣木粕最適合酶解的蛋白為清蛋白。

1.2.2 辣木粕清蛋白和抗氧化肽的制備 （1）辣木粕清蛋白（Moringa meal albumin，MMA）的制備。稱取80 g 辣木粕，加入10 倍蒸餾水，50℃水浴靜置提取30 min，然后50℃超聲輔助提取20 min，過濾。所得上清液加入甲醇進行沉淀，將沉淀物即MMA 冷凍干燥24 h，于-20 ℃保存備用，甲醇通過旋轉蒸發儀回收利用。

（2）辣木粕抗氧化肽（Moringa meal antioxidant peptide，MMAP）的制備。以蒸餾水作溶劑，配制底物濃度為5%的MMA 溶液，加入蛋白酶（5 000 U/g）酶解4 h，沸水浴滅酶10 min，8 000 r/min、-4℃下離心10 min。將上清液用蒸餾水定容至10 mL，制得酶解產物液，將其冷凍干燥24 h，制備得到MMAP。

1.2.3 蛋白酶篩選試驗 分別選取風味蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶以及菠蘿蛋白酶對MMA 進行酶解試驗（表1）。以蛋白水解度（Degree of hydrolysis，DH）為指標，根據表1 的條件進行酶解反應，以MMA 作底物，篩選合適的試驗用酶。

表1 蛋白酶酶解條件Table 1 Protease digestion conditions

1.2.4 單因素試驗 采用控制變量法，以蒸餾水為提取溶劑。以固定底物濃度5%、加酶量5 000 U/g、pH 7.0、酶解時間4 h、酶解溫度50℃為單因素試驗條件，DH 為測定指標，分別考察加酶量（1 000、3 000、5 000、7 000、9 000 U/g），酶解時間（1、2、3、4、5 h），pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5），酶解溫度（40、45、50、55、60、65℃），底物濃度（5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%）等因素對酶解效果的影響。

1.2.5 響應面試驗 根據單因素試驗結果，設計Box-Behnken 響應面試驗，其因素水平見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計因素水平Table 2 Box-Behnken experimental design factor and level

1.2.6 指標測定 辣木粕上清液中蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法G-250［17］進行測定，根據標準曲線y=4.5264x+0.7211（R2=0.9987）計算蛋白提取率。將由1.2.2 所制備已滅酶活的酶解液稀釋100 倍，采用茚三酮比色法［18］測定酶解液中的游離氨基酸含量，根據標準曲線y=2.5699x-0.5254（R2=0.9998）計 算DH。采用雙縮脲常量法［19］測定由1.2.2 所制備已滅酶活的酶解液中的多肽含量，所測多肽含量范圍為0～10 mg/mL，根據標準曲線y=0.0147x+0.0056（R2=0.9975）計算多肽得率。

1.2.7 微波輔助酶解試驗 采用自制微波反應器，在10 mL PE 管中插入溫度傳感器實時監控反應溫度的變化。根據1.2.5 篩選的最適條件，稱取0.72 g MMA，加入8 mL 蒸餾水，加入風味蛋白酶進行酶解，將微波控制源調節到60 W，將酶解溫度控制在40～60℃。反應結束后沸水浴滅酶10 min，8 000 r/min、-4℃下離心10 min，上清液定容至10 mL，測量其蛋白水解度、多肽濃度和抗氧化活性。MMA 酶解設4 個處理：處理1為空白對照，不加蛋白酶，將MMA 在45 ℃恒溫水浴磁力攪拌鍋中反應3.88 h；處理2：將其在低功率微波儀器（60 W）中酶解15 min，然后在45 ℃恒溫水浴磁力攪拌鍋中酶解1 h；處理3：將其在低功率微波儀器（60 W）中酶解30 min；處理4：將MMA 在45 ℃恒溫水浴磁力攪拌鍋中酶解3.88 h。

1.2.8 體外抗氧化活性測定 將1.2.2 所制備的MMAP 用蒸餾水配制成0、2、4、6、8、10 mg/mL的多肽溶液，以相同濃度的Vc 作為陽性對照，測定以下4 個指標：O2-·清除能力參照孫立［20］的方法，用酶標儀在325 nm 下進行測定；還原能力參照田旭靜［21］的方法，采用紫外分光光度計在700 nm 下進行測定；ABTS+·清除能力參照Arnao 等［22］的方法，用酶標儀在734 nm 下進行測定；DPPH·清除能力參照Ma 等［23］的方法，用酶標儀在517 nm 下進行測定。

試驗數據采用SPSS 軟件進行統計分析，用Origin Pro 8 繪圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白質和蛋白酶的篩選

由Osborne 分級提取結果（圖1）可知，辣木粕中清蛋白的提取率最高、為27.73%，谷蛋白次之、提取率為25.34%，醇溶蛋白和球蛋白含量較少、提取率分別為18.68%和6.98%，因此選用辣木粕清蛋白進行酶解。由圖2 可知，風味蛋白酶和復合蛋白酶的酶解效果明顯高于堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，因此選用風味蛋白酶和復合蛋白酶進行復酶篩選。由圖3 可知，風味蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶（1 ∶1）、風味蛋白酶和復合蛋白酶（1 ∶2）、風味蛋白酶和復合蛋白酶（2 ∶1）酶解MMA 的DH 分別為31.18%、13.93%、28.28%、25.81%、30.73%，以風味蛋白酶單獨酶解MMA 的DH 最高，因此選用風味蛋白酶作為MMA 的酶解蛋白酶。

圖1 辣木粕谷蛋白、清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的提取率Fig.1 Extraction rates of gluten,albumin,globulin and gliadin in Moringa meal

圖2 不同蛋白酶對MMA 水解度的影響Fig.2 Effects of different proteases on DH of MMA

圖3 商品蛋白酶復篩結果Fig.3 Re-screening result of commercial proteases

2.2 單因素試驗

由圖4A 可知，酶解時間在0～4 h 之間，DH隨時間幾乎呈線性增加，4 h 之后DH 變化趨于平緩，DH 無顯著性差異，因此選擇4 h 為最佳酶解時間，其DH 為31.18%。由圖4B 可知，DH 隨加酶量增大而增大，當加酶量增大到7 000 U/g 后，DH 變化趨于平緩，DH 無顯著性差異，因此選擇7 000 U/g 為最適加酶量，此時DH 為35.10%。由圖4C 可知，MMA 的濃度在5%～9%范圍內，DH 陡然增加，而在9%～11%范圍內DH 有所下降，但無顯著性差異，在11%～17%之間DH 陡然下降，因此選用底物濃度9%為最佳酶解底物濃度，此時DH 為55.79%。由圖4D 可知，在溫度40～45℃之間DH 隨溫度增加而增加，在溫度在55～65℃之間DH 隨溫度增加而減小，因此選取45℃時為最適反應溫度，此時DH 為67.28%。由圖4E 可知，在pH 6.0～7.5 之間DH 隨pH 增加而增加，在pH 為7.5～8.5 之間DH 隨pH 增加而減小，因此選擇pH 7.5 為最適pH，此時DH 為69.28%。

圖4 酶解時間、加酶量、溫度、底物濃度、pH 對水解度的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time,enzyme volume,temperature,substrate concentration and pH on DH

2.3 響應面試驗

采用Design-Expert V8.0.6 優化MMA 酶解條件，選取水解時間、加酶量、底物濃度進行3 因素3 水平Box-Benhnken 響應面試驗，結果見表3。

表3 響應面試驗結果Table 3 Response surface test results

2.3.1 有效性及顯著性分析 由表4 可知，響應面試驗回歸模型的P-Prob＞P＜0.0001，表現為極顯著，因此該模型具有顯著性，表明該模型可信。殘差主要由隨機誤差產生，通過檢驗虛擬項P-Prob＞P=0.0729＞0.05，說明未知因素對結果基本不產生顯著影響，可以對后續結果進行分析。同時，試驗模型相關系數為R2=0.9873，說明試驗正確率達98.73%，通過矯正調整R2Adj=0.9709，說明試驗的可信度高達97.09%，具有統計學意義。

由表4 還可知，影響因素從大到小為底物濃度（C）＞加酶量（B）＞酶解時間（A），其中底物濃度（C）和加酶量（B）對蛋白水解度的影響極顯著（P＜0.01），酶解時間（B）對蛋白水解度的影響顯著（P＜0.05），說明試驗選取的3 個因素對蛋白水解度影響均較大。模型中，AB（酶解時間和加酶量）之間的相互影響表現為不顯著（P＞0.05），AC（酶解時間和底物濃度）、BC（加酶量和底物濃度）之間的相互影響表現為顯著。A2、B2、C2均表現為極極顯著（P＜0.001），表明各因素之間不是簡單的線性關系，而是具有交互作用［24］。通過分析得到多元回歸方程：Y=68.89-1.37A+2.67B+3.22C+1.82AB-2.17AC-0.17BC-7.78A2-5.14B2-8.95C2。

2.3.2 響應面及等高線分析 選用Design-Expert V8.0.6 軟件對響應面試驗結果繪制三維曲面圖以及等高線圖。曲面和等高線的形狀不同，交互效應的強弱也不同。交互項的等高線圖越近似橢圓形，且曲面圖越陡峭，表明交互作用越強［25］。由圖5 可以看出，3 組交互作用中，底物濃度和水解時間的交互作用最強，其次是加酶量和底物濃度的交互作用，而水解時間和加酶量的交互作用不顯著，這與表4 顯著性檢驗結果完全符合。

圖5 三維曲面圖和等高線圖Fig.5 Three-dimensional surface diagram and contour diagram

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance in regression

通過模型預測在水解時間3.88 h、加酶量7491.44 U/g、底物濃度9.36%時，獲得最大預測值DH 為69.56%。通過驗證試驗測得實際DH 為69.94（±0.68）%，多肽得率為19.09（±0.30）%，表明響應面試驗預測結果可信度較高。

2.4 微波處理對MMA 多肽、水解度和抗氧化活性的影響

由表5 可知，各處理MMA 的多肽得率表現為處理2＞處理4＞處理3＞處理1，以空白對照最低，通過微波預處理15 min ＋常溫水浴1 h 的多肽得率最高；水解度表現為處理4＞處理2＞處理3＞處理1，以空白對照最低，常規水浴酶解處理的DH 最高。當多肽濃度為30 mg/mL 時，DPPH·的清除率表現為處理2＞處理3＞處理4＞處理1，ABTS+·的清除率表現為處理2＞處理3＞處理4＞處理1，還原能力表現為處理2＞處理3＞處理4＞處理1，表明空白對照的抗氧化活性最低，采用微波預處理15 min+常溫水浴酶解1 h 的MMA 的抗氧化活性最強。單獨采用微波酶解的MMA，可能是由于微波功率相對較低，達不到較好的酶解效果；常規水解3.88 h 的抗氧化活性略低，可能是較長時間反應對多肽的活性有一定影響。因此選取微波預處理15 min，再進行水浴酶解1 h，能夠達到較好的酶解效果，且能夠縮短酶解時間，提高酶解效率，所制備的MMAP抗氧化活性較強。

表5 微波處理對MMA 的多肽、水解度和抗氧化活性的影響Table 5 Effects of microwave treatment on peptides,DH and antioxidant activity of MMA

2.5 辣木粕多肽的抗氧化活性測定

由圖6 可知，MMAP 的抗氧化活性明顯高于對照，說明酶解有助于提高MMA 的抗氧化活性，DPPH·、ABTS+·、O2-·的清除率以及還原能力均隨著MMAP 質量濃度的增加而增強，兩者存在一定的量效關系。當MMAP 的質量濃度較低時，DPPH·、ABTS+·、O2-·的清除率以及還原能力與Vc 相差較大，隨著MMAP 質量濃度的增大，差距越來越小。MMAP 清除DPPH·的最佳質量濃度為10 mg/mL，清除率為96.67%，與陽性對照Vc 相當；還原Fe3+的最佳質量濃度為50 mg/mL，還原能力為1.75，達到陽性對照Vc的58.76%；清除ABTS+·、O2-·的最佳質量濃度均為50 mg/mL，ABTS+·、O2-·的清除率分別為98.60%和75.46 %，與陽性對照Vc 相當。MMAP抗氧化活性強這一特性，使MMAP 有望更好地被應用到天然抗氧化劑和功能性食品領域，進而研究開發，實現利用價值。

圖6 MMAP 的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of MMAP

3 討論

籽粕用來酶解的蛋白主要有清蛋白和谷蛋白，堿提酸沉得到的谷蛋白廣泛用于酶解技術中的蛋白質分離，涉及在堿性pH 條件下（如pH 8～10）溶解植物蛋白質，然后在等電點（如pH 3～5）沉淀得到蛋白質［26］。也有研究采用溶于水的清蛋白和溶于NaCl 的球蛋白用于酶解技術［27］。本研究中，辣木粕清蛋白和谷蛋白含量（27.73%、25.34%）差異不顯著，大部分活性蛋白都屬于谷蛋白或清蛋白，承載著生命體的新陳代謝，支撐著機體活動及功能，但清蛋白的提取工藝最為簡單，因此選用清蛋白進行酶解［28］。酶解常有單一蛋白酶和復合蛋白酶兩種方式，由于蛋白酶本身也是蛋白質，可能會使兩種蛋白酶相互水解，從而使兩種酶活性都不能達到最高，因此有的研究也采用單一蛋白酶進行酶解［29］。由于酶具有特異性，不同來源的酶與不同的底物酶解效果都大不相同，因此要對酶進行篩選。蛋白酶可分為內切酶和外切酶2 種，外切酶專門作用于肽鏈末端的肽鍵，內切酶則作用于肽鏈內部特定區域。常用于動植物蛋白水解的中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶屬于內切酶，在水解過程中內切酶切斷多肽內部的肽鍵，形成短鏈肽，其中一些含有疏水氨基酸，因而成為苦味肽［30］。本研究采用的風味蛋白酶是利用米曲霉發酵，經先進的提取工藝微濾、超濾、真空冷凍干燥技術精制而得，風味酶包含內切蛋白酶與外切肽酶兩種活性，可以用來去除低水解度產物的苦肽鏈，將其徹底降解為氨基酸，也可用于徹底水解蛋白質，增進和改善水解液的風味［31］。來源于微生物的蛋白酶相比來源于動物的蛋白酶成本更加便宜，且比來源于植物的蛋白酶專一性更強。采用單一風味蛋白酶酶解時，操作簡單，成本低，因此選用風味蛋白酶為辣木粕清蛋白的酶解蛋白酶。

酶解初期，蛋白水解度隨著時間增大而增大，一定酶解時間后，底物與酶結合基本反應完全，之后隨著時間的延長蛋白水解度也無顯著性差異；隨著加酶量的增加，底物被酶解得越充分，當酶加到一定程度時，可能會由于底物不夠而不能充分酶解，因此蛋白水解度無顯著性差異；隨著底物濃度的增加，蛋白水解度會隨之增加，當底物達到“飽和”狀態，風味蛋白酶不足以完全水解底物，導致底物過剩，蛋白水解度降低［32］。過高或者過低的溫度和pH 都會使酶失活，因此只有在每個酶的最適溫度和pH 時，能夠達到較好的酶解效果。研究表明，許多籽粕經過酶解后都具有抗氧化活性，其原因可能是蛋白質通過酶解降解成為多肽和氨基酸，大分子的蛋白不具有活性，只有降解成為小分子多肽時才具有活性。傳統酶解方法耗時長，酶解過程難以控制，近年來微波輔助蛋白酶解技術的發展有利于快速、高效、選擇性制備生物活性肽［33］。微波輻射會導致蛋白質結構疏松，并暴露與酶的結合位點，而結合位點的暴露極大地加速了酶消化過程，增強酶對蛋白質的水解作用，在釋放小分子量的生物活性肽時獲得更高的產量［34］。在微波輔助酶解的研究中人們發現由于微波對樣品具有快速加熱作用，局部過高的溫度容易造成蛋白變性及酶失活。本研究采用0～100 W 的低功率微波控制源，使辣木粕清蛋白控制在最適反應溫度的同時，還有連續的微波作用，由此提高了酶解效率。

4 結論

本研究結果表明，辣木粕清蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和球蛋白的提取率分別為27.73%、25.34%、18.68%、6.98%，以清蛋白的提取率最高，因此選取清蛋白用于酶解；辣木粕清蛋白的酶解選用風味蛋白酶單獨酶解時效果最佳，其水解度達31.18%。通過單因素和響應面試驗，發現辣木粕清蛋白最優酶解條件為：時間3.88 h、加酶量7 491.44 U/g、底物濃度9.36%、溫度45℃、pH 7.5，此條件下DH 為68.90%，多肽得率為19.09%；低功率微波預處理15 min，將酶解時間縮短至1 h，可得到含量較高和抗氧化活性較強的多肽。辣木粕多肽具有較好的抗氧化活性，在最佳質量濃度時，其對DPPH·、ABTS+·、O2-·的清除能力與Vc 相當。低功率微波輔助酶解能夠縮短酶解時間，提高酶解效率和酶解產物的抗氧化活性。