魚腥草總黃酮對小鼠結腸炎防治作用的研究

楊樂天，楊晨，顏曉飛，石暢，左庚鑫，陳芳

(聊城大學藥學院，山東 聊城 252059)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)，是一種常見的炎癥性腸道疾病，具有慢性、反復性、非特異性等特點[1-2]。該病的發病部位主要集中在大腸、結腸黏膜及黏膜下層[3]。UC的發病機制目前尚未明確，通常認為該病的病因與遺傳、環境、免疫系統和腸道菌群等因素有關[4]。患者的臨床癥狀主要表現為嚴重腹瀉、腹痛、便血和腸道菌群失衡[5]等。近年來，UC在亞洲的發病率呈增長趨勢[6]。目前用于治療UC的西藥[7]存在治療效果不穩定及其副產物對肝腎有毒性等問題[8]。因此，研究篩選治療效果穩定且毒副作用小的藥物成為臨床治療UC的當務之急。

魚腥草(HC)是一種具有特殊氣味的多年生、三白草科草本植物，在日本、韓國、中國都有分布[9]。HC具有較高的食用和藥用價值，它在傳統保健[10]和治療中發揮著重要的作用。目前大量的科學數據也證實了HC提取物擁有潛在的價值[11-14]。魚腥草總黃酮為魚腥草活性成分之一，具有抑菌、抗過敏和延緩衰老等作用[15]。本研究選取魚腥草總黃酮作為本實驗的研究對象，建立小鼠結腸炎模型，通過分析魚腥草總黃酮對結腸炎小鼠體重變化、炎癥因子等指標的影響，探索魚腥草總黃酮對小鼠UC的治療作用，克服目前臨床主流藥物效果不穩定及毒副作用等問題，為今后UC的臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性ICR小鼠，SPF級，體重16～20 g。購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[生產許可證號：SCXK9(魯)20190003]。單籠飼養(29 cm×18 cm×16 cm),光照12L∶12D，溫度(23±1)℃，適應環境7 d，自由取食(北京科澳協力飼料有限公司生產的小鼠飼料)和飲水。

1.2 主要試劑與儀器設備 魚腥草提取物(10∶1，西安瑞林生物科技有限公司)；纖維素酶(10 000 U·L-1，南寧東恒華道生物科技有限公司)；葡聚糖硫酸鈉鹽(MW36000-50000，上海翊圣生物科技有限公司)；免疫試劑盒(TNF-α、IL-1α、IP10和IFN-γ，武漢云克隆科技有限公司)；免疫試劑盒(Cr、BUN、ALT和AST，南京建成生物工程研究所)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、多聚甲醛(北京Solarbio公司)。

電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司(GB/T26497)]；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；立式壓力蒸汽滅菌器[濟南德強儀器有限公司(MJ376CD)]；優普系列超純水儀[成都超純科技有限公司(UPR-I-10T)]；漩渦振蕩器[大龍生物科技有限公司(MX-E)]；海信冰箱[海信(北京)電器(BCD-230F/WS)]。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚腥草總黃酮的制備及檢測 稱取魚腥草提取物5 g，加入纖維素酶至終濃度300 U·mL-1，參考梁燕妮等[16]的提取魚腥草總黃酮工藝條件,本實驗選用的提取條件為料液比1∶30，超聲波輔助提取18 min，超聲功率為300 W，乙醇濃度為55%，溫度為室溫。過濾后取上清液用石油醚1∶1萃取，40 ℃旋轉蒸發至干燥，用60%乙醇溶出，采用冷凍干燥的方法得到總黃酮凍干粉。以含量較高的蘆丁為標準品對照，采用高效液相色譜法測定魚腥草總黃酮溶液的含量。

1.3.2 小鼠DSS模型建立及藥物治療 將小鼠隨機分為6個組：空白對照組、DSS模型組、柳氮磺胺吡啶組、魚腥草總黃酮中劑量組、魚腥草總黃酮高劑量組、蘆丁組，每組10只小鼠。小鼠適應環境7 d，正常組小鼠自由飲用二次水，給予足量的鼠糧；其他組小鼠參考藥量為0.1～0.3 mL/10 g[17]，每天定時用3.5% DSS溶液自由飲水處理，連續飲用9 d，接著與正常組小鼠一樣，連續3 d自由飲用二次水，整個建模周期為12 d。每天記錄小鼠體重、糞便黏稠度和糞便隱血情況。誘導期結束后，除空白對照組和DSS模型組外，其他4個組用對應藥物對小鼠進行灌胃處理，藥物處理時間為6 d。

1.3.3 疾病活動指數 小鼠DAI指數，又稱為疾病活動指數，即DAI Score=體重下降評分+糞便黏稠度評分+糞便隱血評分[18]。體重下降評分標準：0～5% 1分，5%～10% 2分，10%～15% 3分，>15% 4分。糞便黏稠度評分標準：正常0分，稀便2分，腹瀉3分。糞便隱血評分標準：正常0分，陽性2分，血便3分。每天按照小鼠編號記錄小鼠體重、糞便黏稠度和糞便隱血情況。

1.3.4 肝腎系數、結腸系數和組織病理學切片 取出小鼠肝腎和結腸，做好稱重記錄。結腸系數=結腸長度/體重；肝腎系數=肝腎質量/體重。結腸病理切片的石蠟包埋、切片、HE染色等工作由濟南賽維爾公司完成。

1.3.5 炎癥因子和肝腎功能因子測定 小鼠眼球取血，離心取血清-80 ℃保存備用，用于炎癥因子和肝腎功能因子的測定，炎癥因子的測定采用酶聯免疫吸附試劑盒測定，肝腎功能因子肌酐、血尿素氮、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶均采用試劑盒測定。

1.3.6 腸道菌群的測定 收集小鼠糞便進行16S rRNA V4區擴增構建測序文庫，相關工作由天津諾禾致源生物信息科學有限公司完成。

1.3.7 統計學分析方法 采用IBM SPSS 24.0軟件對組間數據進行比較分析，各組數據結果都以Mean±SD的形式表示，組內采用ANOVA單因素方差分析，P≤0.05，表示有顯著性差異。運用GraphPad Prism 8.0進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 魚腥草總黃酮的制備及檢測 本實驗以魚腥草葉片純提取物為原料，采用HPLC對魚腥草總黃酮提取物與蘆丁標準品進行檢測。在283 nm處，蘆丁標準品100 mg·L-1的保留時間在14.764 min，魚腥草總黃酮提取物保留時間在13.249 min，可以判斷魚腥草總黃酮中含有蘆丁這種物質，并且根據峰形可看出，提取效果良好。圖1～2為蘆丁標準液與魚腥草總黃酮對照色譜。

圖1 蘆丁標準品色譜圖

圖2 魚腥草總黃酮提取物蘆丁成分色譜圖

2.2 小鼠體重變化及DAI指數測定 表1為圖1對應的小鼠體重變化數據。建模成功后，從第13天開始給藥，第15天、第18天時，與治療組小鼠相比較，DSS模型組小鼠的體重極顯著下降，空白對照組與DSS模型組相比，體重極顯著增加(見圖3)，P<0.01。其中，魚腥草總黃酮中、高劑量在改善體重下降的治療效果上沒有顯著差異，魚腥草總黃酮高劑量比蘆丁改善效果好，但不如SASP效果好。可見魚腥草總黃酮對DSS誘導小鼠腸炎所致的體重下降有一定的改善作用。

表1 小鼠體重變化(Mean±SD，n=10)

圖3 小鼠體重變化

由圖4可知，魚腥草總黃酮中、高劑量治療組的小鼠DAI評分相比DSS模型組小鼠顯著降低，并且具有統計學意義(P<0.05)；蘆丁組和SASP組小鼠DAI評分極顯著降低(P<0.01)。但魚腥草總黃酮中、高劑量組的DAI評分與蘆丁組DAI評分差異不顯著，因此可判斷總黃酮在治療DSS小鼠腸炎的過程中效果與蘆丁相當。

圖4 魚腥草總黃酮對小鼠DAI指數的影響

2.3 結腸外觀和結腸系數 由圖5可知，魚腥草總黃酮可以改善DSS導致的結腸腫脹，并且可以顯著減少DSS小鼠結腸縮短的程度(P<0.05)。由圖6可知，與DSS組相比，魚腥草總黃酮高劑量組的結腸系數降低有統計學差異(P<0.01)；魚腥草總黃酮中劑量組的結腸系數降低有統計學差異(P<0.05)。

圖5 魚腥草總黃酮對小鼠結腸外觀形態的影響

圖6 魚腥草總黃酮對小鼠結腸系數的影響(Mean±SD，n=10)

2.4 肝腎系數 由圖7可知，DSS誘導的小鼠肝腎系數會極顯著增加(P<0.01)，SASP組略高于空白對照組，考慮到可能是連續服用SASP產生的副產物對小鼠肝腎代謝帶來多余的負擔，使得SASP組的肝腎系數相對增加。

2.5 組織病理學切片 從圖8腸切片可以看出，DSS模型組腸黏膜外壁和內壁厚薄不均，黏膜內層有潰瘍面形成，炎性細胞增多，隠窩變形粘連；空白組小鼠腸黏膜完整且上皮排列有序，無炎性細胞浸潤，隠窩清晰；中劑量黃酮組還存在著少量的潰瘍面和炎性細胞浸潤，相比DSS組病變程度減輕了很多；高劑量黃酮組未見明顯的潰瘍面，隠窩結構和黏膜壁厚度也較為清晰，但是恢復效果不如SASP組，蘆丁組切片中，還存在著少量的炎性細胞，但是腺體結構較為完整，比中劑量組要改善很多。這說明魚腥草總黃酮可以改善DSS誘導的結腸潰瘍，并且治療效果呈劑量依賴關系。

圖8 小鼠結腸病理組織切片分析

2.6 炎癥因子 由表2所示，DSS模型組中IFN-γ、IL-1α、IP10和TNF-α 4種炎癥因子的含量都遠高于空白對照組，統計分析，兩組之間差異極顯著P<0.01；對比給藥組和DSS模型組可以發現，給藥組的炎癥因子含量要低于DSS模型組，并且差異極顯著，P<0.01；但是給藥組炎癥因子含量整體水平都要高于空白對照組，其中魚腥草總黃酮高劑量組和SASP組降低炎癥因子的效果較好。

表2 TNF-α、IL-1α、IP10和IFN-γ水平

2.7 肝腎功能因子 由表3所示，DSS模型組在ALT、AST、CR和BUN水平上表達量上調，并且顯著高于空白對照組，兩組之間差異極顯著，P<0.01；對比給藥組和DSS組，可以發現，魚腥草總黃酮中、高劑量組在ALT、AST、CR水平上，極顯著低于DSS模型組，P<0.01；在BUN水平上，魚腥草總黃酮高劑量組顯著低于DSS模型組，P<0.05；SASP組在ALT和CR水平上略高于給藥組，考慮可能為SASP對肝腎帶來的副作用。結果表明，魚腥草總黃酮可以減輕DSS帶來的小鼠肝腎指標異常，對肝腎起到了一定的保護作用。

表3 小鼠血清中ALT、AST、CR和BUN水平檢測

2.8 腸道菌群的測定 從圖9可看出，樣品量較少時，箱型圖的增勢較陡，表明樣本量不足，不能完全反應物種豐富度，但隨著樣本量的增多，箱型圖陡勢減弱并逐漸趨于平緩，表明樣本量充足，沒有新的物種出現，可以進行樣本分析。

圖9 物種累積箱型圖

擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形桿菌門(Proteobacteria)均為優勢菌群，它們是腸道內普遍存在的主要菌群。由圖10表明，與空白對照組相比，其他組的厚壁菌門所占腸道菌群的比例顯著減小，而擬桿菌門和變形菌門占比增加。除DSS組以外，可以直觀地看到魚腥草總黃酮中、高劑量組的腸道菌群構成比例接近空白對照組，可見魚腥草總黃酮可以改善小鼠腸道內菌群的分布。其中G2改善效果最好，其次是G1，最后是G3。SASP雖然可以治療小鼠結腸炎，但對小鼠腸道菌群的分布有不利的影響，這一點可以看魚腥草總黃酮在治療腸炎和改善腸道內菌群分布具有一定的優勢。

圖10 小鼠腸道菌群門水平上的物種相對豐度柱形圖

3 結論

近年來，黃酮類化合物因其抗炎、抗氧化和增強機體免疫機能等活性[19]，在防治潰瘍性結腸炎方面逐漸成為研究的熱點。本實驗探索了魚腥草總黃酮對小鼠潰瘍性結腸炎的治療作用。綜上所述，魚腥草總黃酮提取物可有效改善結腸炎造成的小鼠體重下降、便血、腸梗阻和腸黏膜損傷等病理現象，降低疾病指數、結腸系數和肝腎系數，有效抑制炎癥因子和肝腎因子的提高，并且在一定程度上呈劑量依賴性。另外通過小鼠腸道菌群宏基因組分析可得，魚腥草總黃酮可以從不同程度上改善菌群種類的比例分布，維持腸道微生態穩定。因此，魚腥草總黃酮的作用機制可能是抑制炎癥因子的表達量上調，調節腸道微生態紊亂，其具體的作用機制需要進一步研究與證實。這些發現為進一步研究魚腥草黃酮的藥理作用提供了新的思路，同時魚腥草是一種藥食同源的植物，種植成本低且幾乎無毒副作用。因此，魚腥草黃酮可以作為一種新的結腸炎防治候選藥物進行開發利用。