仙芪扶正顆粒定性定量方法研究

劉學(xué)杰，張俊生,杜麗君，馬靜華

(1.煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 煙臺(tái) 264000；2.煙臺(tái)市中醫(yī)醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264000)

仙芪扶正顆粒是由仙鶴草、黃芪、陳皮、黨參、茯苓、酒黃精、枸杞子、酒女貞子、鹽菟絲子、當(dāng)歸、雞血藤、地榆、大棗、甘草14味中藥經(jīng)過(guò)水煎提取而制成的醫(yī)療機(jī)構(gòu)復(fù)方制劑，經(jīng)大量臨床實(shí)踐證明該制劑對(duì)于腫瘤放化療后血細(xì)胞減少癥及食少納呆、體倦乏力等脾腎虛弱、氣血虧虛之癥具有很好的治療效果。本方臨床使用已有十余年，具有堅(jiān)實(shí)的臨床基礎(chǔ)。仙芪扶正顆粒目前并無(wú)明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為了更好地對(duì)仙芪扶正顆粒的質(zhì)量加以控制，本文作者在查閱相關(guān)文獻(xiàn)[1-4]基礎(chǔ)上開(kāi)展研究，方中君藥仙鶴草并無(wú)明顯的指標(biāo)性成分可供做含量測(cè)定，黃芪雖有指標(biāo)性成分黃芪甲苷，但本文作者嘗試后發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷回收率不符合要求，因此本文選擇對(duì)陳皮中橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定。此外，本文除了對(duì)黃芪、枸杞子、陳皮、地榆進(jìn)行薄層鑒別外，還參照《中國(guó)藥典》2020年版(一部)對(duì)茯苓、黃精、酒女貞子、鹽菟絲子、當(dāng)歸、雞血藤等進(jìn)行定性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上各位藥材薄層色譜干擾嚴(yán)重，其樣品的分離度未能達(dá)到制定標(biāo)準(zhǔn)的要求，故在初步制定標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程中未納入正文。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)安捷倫1200高效液相色譜儀；日本島津 Auw120D電子天平；KQ-300DE超聲波儀器。青島基億達(dá)硅膠G板；水為Milipore制水機(jī)制備。

1.2 試藥 黃芪甲苷(批號(hào)：110781-201717)、黃芪(批號(hào)：120974-201612)、枸杞子(批號(hào)：121072-201611)、橙皮苷(批號(hào):110721-201818)、地榆(批號(hào)：121286-201703)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；仙芪扶正顆粒樣品及陰性供試品為制劑室自制(批號(hào)分別為20190501、20190502、20190503)；乙腈為進(jìn)口色譜純(Fisher)；試驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 黃芪 取本品適量，研細(xì)，稱(chēng)取10 g置圓底燒瓶，水浴回流1 h，取濾液蒸干，殘?jiān)执渭铀?0 mL使溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，以水飽和的正丁醇30 mL萃取2次，正丁醇液以2% NaOH溶液洗滌2次，每次40 mL，棄去洗液，加正丁醇飽和的水液50 mL洗滌，取正丁醇液置水浴使蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取黃芪對(duì)照藥材1 g(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)同法制成對(duì)照藥材溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液[5]。取上述制備液于同一色譜板展開(kāi)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.缺黃芪空白；2.黃芪甲苷；3.黃芪；4、5、6.三批供試品

2.2 枸杞子 取本品10 g，研細(xì)，加水50 mL使溶解，超聲30 min，濾過(guò)，取濾液用乙酸乙酯30 mL萃取2次，合并萃取液置水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。

另取枸杞子對(duì)照藥材1 g(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)同法制成枸杞子對(duì)照藥材溶液[6]。取上述制備液于同一色譜板展開(kāi)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

1.缺枸杞子空白；2.枸杞子；3、4、5.三批供試品

2.3 陳皮 取本品18 g，研細(xì)，加乙醇50 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，乙醚提取2次，每次20 mL,棄去乙醚液，水液用水飽和的正丁醇液40 mL分兩次提取，再以正丁醇飽和的水50 mL分次洗滌，取正丁醇液，蒸干，加甲醇2 mL溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤骸Ａ砣〕绕ぼ?.5 mg加甲醇1 mL使溶解，作為對(duì)照品溶液。取上述制備液于同一色譜板展開(kāi)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

1.缺陳皮空白；2.橙皮苷；3.陳皮；4、5、6.三批供試品

2.4 地榆 另取地榆對(duì)照藥材0.5 g,加甲醇20 mL回流提取30 min，放置室溫，取濾液蒸干，殘?jiān)执渭铀?0 mL使溶解，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用水飽和的正丁醇40 mL分兩次萃取，合并萃取液，分別用2% NaOH溶液和正丁醇飽和的水洗滌2次，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為地榆對(duì)照藥材溶液。取“2.1”項(xiàng)下制備液于同一色譜板展開(kāi)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

1.缺地榆空白；2.地榆對(duì)照藥材；3、4、5.三批供試品

3 橙皮苷含量測(cè)定

3.1 溶液的制備

3.1.1 樣品處理及供試品溶液的制備 取裝量差異下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱(chēng)定3 g置平底燒瓶，精密加入甲醇50 mL，秤定，水浴回流1 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減少重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取橙皮苷對(duì)照品11.45 mg加甲醇制成每1 mL含橙皮苷45.8 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

3.1.3 缺陳皮空白溶液的制備 取陳皮陰性供試品按照“3.1.1”項(xiàng)下制備方法，制成陳皮陰性供試品溶液。

3.2 色譜條件 色譜柱：C18柱；流動(dòng)相：乙腈-0.01%磷酸溶液(20∶80)；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm，柱溫箱溫度30 ℃[5,7]。理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

3.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取上述“3.1.1”“3.1.2”“3.1.3”項(xiàng)下制備溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與橙皮苷對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，有相同的吸收峰，而陳皮陰性供試品溶液色譜無(wú)明顯干擾，見(jiàn)圖5～7。

圖5 橙皮苷對(duì)照品

圖6 供試品

圖7 缺陳皮供試品

3.3.2 線性關(guān)系考察 取橙皮苷對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣0.114 5、0.229、0.458、0.572 5、1.374、2.29 μg，按照“3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積積分值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果進(jìn)樣量在0.114 5～2.29 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：Y=25.627X+1.775 6，r=0.999 7，結(jié)果見(jiàn)表1，線性關(guān)系見(jiàn)圖8。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

圖8 橙皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.3 精密度試驗(yàn) 取同份仙芪扶正顆粒，按照“3.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL。結(jié)果6次測(cè)定峰面積的RSD為0.60%，表明精密度良好(見(jiàn)表2)。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同份仙芪扶正顆粒，按照“3.1”項(xiàng)下制備成供試品溶液，每隔約2 h進(jìn)樣測(cè)定1次，每次進(jìn)樣10 μL，共測(cè)定6次。結(jié)果顯示，6次測(cè)定橙皮苷測(cè)定峰面積RSD為1.46%，表明在10 h內(nèi)橙皮苷的穩(wěn)定性良好(見(jiàn)表3)。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批仙芪扶正顆粒(批號(hào)：20190501)樣品6份，按含量測(cè)定項(xiàng)下，依法測(cè)定含量，6次測(cè)定結(jié)果范圍在0.611～0.624 mg·g-1，RSD為0.97%，說(shuō)明重現(xiàn)性良好，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

3.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批仙芪扶正顆粒(批號(hào)：20190501)樣品6份，每份約1.5 g，精密稱(chēng)定，分別以低、中、高3個(gè)水平精密加入橙皮苷對(duì)照品0.757、0.947、1.136 mg，按照“3.1.1”項(xiàng)下制備成供試品溶液，并按照“3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.3.7 樣品的測(cè)定 取不同批次的仙芪扶正顆粒6份，按照“3.1.1”項(xiàng)下制備成供試品溶液，按照“3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算6批仙芪扶正顆粒樣品中橙皮苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 6批仙芪扶正顆粒中橙皮苷的含量測(cè)定結(jié)果

從以上6批中試生產(chǎn)的仙芪扶正顆粒中橙皮苷的含量可知，每克樣品中橙皮苷的含量范圍為0.61～0.63 mg·g-1，考慮到陳皮藥材的質(zhì)量差異，按照《中國(guó)藥典》2020年版(一部)規(guī)定橙皮苷的含量不得低于3.5%，故規(guī)定橙皮苷的含量每袋不得少于3.60 mg(8 g/袋)。

4 討論

4.1 含量測(cè)定中橙皮苷提取方法及時(shí)間的選擇 橙皮苷的提取試驗(yàn)考察了超聲和回流兩種不同的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流雖比超聲操作煩瑣，但是更能夠使橙皮苷提取完全。試驗(yàn)中用加熱回流方法提取橙皮苷分別考察了40、60和80 min的提取時(shí)間，結(jié)果表明60 min基本可以使橙皮苷提取完全，因此本文確定加熱回流60 min作為橙皮苷的提取方法。

4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相的選擇 本文取橙皮苷對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描(200～400 nm)發(fā)現(xiàn)橙皮苷在283.0 nm處有最大吸收，結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)，故確定本文含量測(cè)定的波長(zhǎng)為283 nm。試驗(yàn)中對(duì)作者嘗試用甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)[8]以及甲醇-0.11%磷酸溶液(39∶61)[9]作為流動(dòng)相結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.01%磷酸溶液(20∶80)能夠使樣品中橙皮苷分離效果較好且配置簡(jiǎn)單，故本文采用乙腈-0.01%磷酸溶液(20∶80)作為流動(dòng)相。