3株禽副黏病毒4型國內分離株的基因組序列及生物學特性分析

李 崢，舒波，彭程，于曉慧，李金平，侯廣宇，蔣文明，王靜靜，王桂軍，劉華雷

（1.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；2.安徽農業大學動物科技學院，安徽合肥 230000；3.江西農業大學動物科技學院，江西南昌 330000）

目前禽副黏病毒（avian paramyxovirus，APMV）有21 個種，分別為APMV-1—APMV-21。國際病毒分類委員會（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）于2019 年分類報告中設立禽腮腺炎病毒亞科，并基于RNA 依賴的RNA 多聚酶（RdRp）將過去歸為禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus）的1～19型病毒進行了重新分類，其中1、9、12、13、16～19型歸為正禽腮腺炎病毒屬（Orthoavulavirus），2、5～8、10、11、14、15型歸為偏禽腮腺炎病毒屬（Metaavulavirus），3、4型歸為副禽腮腺炎病毒屬（Paraavulavirus）。2019 和2020 年又分別確立了2 種新的禽類副黏病毒——偏禽腮腺炎病毒20型和正禽腮腺炎病毒21型。APMV 是一種有囊膜的單股負鏈RNA 病毒，可感染世界上多數野生及家養禽類。APMV-4 屬于副禽腮腺炎病毒屬，在電鏡下，負染的病毒顆粒一般呈圓形，表面有致密的纖突，且在病毒內部有被囊膜包裹的對稱螺旋核衣殼[1-4]。1975 年，研究人員首次從我國香港地區鴨群中分離到APMV-4[7]，此后從美國、韓國、比利時、南非、俄羅斯等國家的野鳥和水禽中也陸續分離到APMV-4[8]。2012 年，我國內陸地區首次報道發現APMV-4[5]。APMV-4 主要感染雁形目的野鳥和商品化的水禽（鴨、鵝），通常導致感染禽類出現卡他性氣管炎和間質性肺炎[6]。目前，關于APMV-4 基因組和生物學特性的研究較少。本研究對2020 年從我國野鴨和家鴨中新分離的3株APMV-4 毒株進行了基因組測序和序列分析，并對其生物學特性進行了初步研究，以期為進一步研究我國APMV-4 的流行病學分布特點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒來源

APMV-4/Mallard/Ningxia/224-1/2020、APMV-4/Mallard/Ningxia/Y175-1/2020、APMV-4/Duck/Guangdong/G2191/2020 毒株，由中國動物衛生與流行病學中心禽病監測室2020 年在廣東省和寧夏回族自治區的野鴨和家鴨中分離并保存。

1.2 生物學特性分析

1.2.1 病毒繁殖 使用1.0 mL 注射器吸取病毒上清液，按照0.2 mL/枚的劑量，經尿囊腔接種9～11日齡的SPF 雞胚，每個樣品接種5 枚雞胚；接種后，37 ℃繼續孵育，18 h 后每12 h 照胚1 次，并觀察記錄雞胚死亡情況；收集18 h 以后的死胚及96 h仍存活雞胚，置于4 ℃環境中4 h，無菌收取雞胚尿囊液，按照標準方法[16]測定病毒血凝（HA）效價，最終計算各毒株的HA 效價平均值。

1.2.2 雞胚半數感染量（EID50）測定 將病毒液進行10 倍倍比稀釋，取適當稀釋度的病毒液接種雞胚，0.1 mL/枚，每個稀釋度接種5 枚雞胚，96 h 后收獲雞胚尿囊液并測定HA 效價，按照Reed-Muench 方法計算EID50。

1.2.3 病毒致病指數（ICPI）測定 取HA 效價24以上的新鮮病毒液，10 倍稀釋后腦內接種1 日齡雛雞，每組10 只雞，每只接種0.05 mL，接種后連續觀察8 d，每天記錄雞只發病、死亡情況，并打分，最終計算病毒的ICPI 值[16]。

1.3 基因組擴增與測序

采用High Pure Viral RNA Kit（Roche）提取病毒RNA，將提取到的RNA 立即用于RT-PCR擴增或置-20 ℃保存。根據GenBank 中已發表的APMV-4 全基因組序列，運用Oligo 7 軟件設計基因組擴增引物和RACE 引物，并由青島睿博興科生物技術有限公司合成，基因組擴增引物序列詳見表1。利用一步法RT-PCR 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品）進行基因組擴增，按照試劑盒說明書配置反應體系。反應條件：

表1 APMV-4 全基因組擴增引物

50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55～59 ℃30 s，72 ℃ 2 min，共35 個循環；72 ℃ 5 min。利用SMARTer RACE 5′/3′試劑盒（Clontech）擴增病毒基因組5′和3′末端。將RT-PCR 產物送青島睿博興科生物科技有限公司測序。

1.4 遺傳進化分析

利用MEGA-X 軟件，對病毒基因組進行系統進化分析，采用鄰位相連法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹，bootstrap 設置為1 000 次重復。

1.5 數據分析

利用Lasergene 軟件和MEGA-X 軟件進行基因組序列拼接，以及病毒基因組結構和關鍵氨基酸位點分析。

2 結果

2.1 病毒生物學特性

3株APMV-4分離毒株的HA效價為（4～5）log2，EID50為（10-7.62～10-7.65）/0.1mL，ICPI值為0～0.23，均為低致病性毒株。3株APMV-4 分離株的生物學特征見表2。

表2 APMV-4 分離株生物學特征

2.2 病毒基因組序列

3株APMV-4 分離株的基因組序列分析結果顯示：3株毒株的基因組長度均為15 054 nt，基因組結構均為3′-N-P-M-F-HN-L-5′，遵循副黏病毒科的“六堿基原則”；3株毒株的基因組結構與副禽腮腺炎病毒屬的其他成員類似，3′端前導序列長55 nt，5′端尾隨序列長度為17 nt，各個基因間的基因間隔序列（IGS）由9 nt 到42 nt 長度不等（表3、圖1），3株毒株在N/P和HN/L的IGS有1 nt 的微弱差異（表4）；3株毒株的N、P、M、F、HN和L基因5′端非轉錄區（untranslated region，UTR）均長于3′UTR（表3），除N基因外，其余5 個基因片段的起始序列高度保守（3′-UCCCACCCCUUCC-5′）；3株毒株共有的基因終止序列為3′-AAAUUAAUUUUU-5′，但P、M和L基因中分別存在2、6 和1 nt 的差異（表5）。

表4 基因間序列

表5 基因起始及終止序列

表3 APMV-4 分離株的基因組特征和蛋白質特征

3株分離毒株的N 蛋白均編碼457個氨基酸（amino acid，aa），與目前已知的APMV-4毒株相同，并包含高度保守氨基酸序列322FAPGNFPHMYSYAMG336；3株毒株F 蛋白裂解位點序列均為116DIPQR ↓F121，與大部分APMV-4毒株一致，其F 蛋白具有3 個潛在的糖基化位點，分別位于F1 蛋白第260、455 位以及F2 蛋白的第89 位；分離毒株的F 蛋白有2 個七肽重復區（heptad repeat region，HR），與我國香港、韓國分離株相比，僅在F 蛋白頭部非關鍵位點存在11 處氨基酸差異，而HRa 和HRb 區域均未出現變異位點；3株毒株的HN 蛋白具有5 個潛在的糖基化位點，部分毒株HN 蛋白的第57、103、124、153、262、366、424位氨基酸存在變異（表6），但HN 蛋白唾液酸受體結合位點（229NRKSCS234）均未發生變異。

表6 F 蛋白和HN 蛋白氨基酸差異對比

2.3 病毒基因組核苷酸同源性

選取APMV-1—APMV-21 代表株各1株（表7），與本研究中的3株APMV-4 分離株進行基因組核苷酸序列同源性分析。結果顯示：3株分離株與APMV-4 代表株同源性最高（97.2%～97.5%），與APMV-11同源性最低（37.1%），與其余APMV 代表毒株的核苷酸同源性為38.1%～47.3%（圖2）。

2.4 基因組遺傳進化

病毒基因組遺傳進化分析結果（圖3）顯示，3株APMV-4 分離毒株屬于副禽腮腺炎病毒屬，與我國香港、韓國分離株高度同源。

3 討論

自1975 年首次在我國香港地區發現APMV-4以來，在雁形目的野生鳥類和家養的鴨、鵝中也分離到多株該型毒株。APMV-4 雖然經常感染禽類，但其致病力不強[11]。蛋雞感染APMV-4 后僅表現為產白殼蛋[11]，雞人工感染后出現輕度的卡他性氣管炎或腸淋巴組織增生等癥狀，在人工感染雛雞的腸道和胰腺中可檢測到病毒[11]。部分研究[12]結果證明，APMV-4 感染小鼠后，會廣泛分布于肺臟與鼻甲，但通常不導致嚴重的疾病癥狀。與其他型APMV 相比，APMV-4 在雞體內復制力較差，但可在人工感染鴨的氣管和肺中有效復制，說明APMV-4 在鴨體內的復制力較強[12]。本研究中的3株APMV-4 毒株分離自野鴨和家鴨，其在雞胚中的復制力較差，且對雛雞表現為低致病力（ICPI為0～0.23），其生物學特性與大部分APMV-4 分離株一致[13]。

通常情況下，APMV 基因組長度約15 500 nt，且遵循“六堿基原則”。本研究中的3株APMV-4毒株基因組長度均為15 054 nt，與其他APMV-4分離株一致[14]。3株APMV-4 分離株的3′端前導序列長度為55 nt，與大多數APMV 毒株一致。禽副黏病毒5′端尾隨序列長度一般為25～60 nt[15]，而APMV-4 尾隨序列僅為17 nt，是APMV 成員中最短的。分析結果顯示，APMV-4 毒株3′端前導序列與5′端尾隨序列呈現70.3%的互補配對，且基因組3′端序列具有保守性。除此之外，APMV-4的基因啟動序列（3′-UCCCACCCCUUCC-5′）與基因終止序列（3′-AAAUUAAUUUUU-5′）也高度保守，可有效區分基因組內各基因片段。APMV-4 的基因間隔序列與腮腺炎病毒、麻疹病毒和亨尼帕病毒相似[15]。APMV-4 的6 個基因具有六聚體的基因起始序列，且其P基因編輯位點是APMV 中最具特異性的[17]。

副黏病毒F0 蛋白無活性，需被宿主細胞蛋白酶切割成F1 和F2 兩部分才具有生物活性，而F1和F2 蛋白依靠F1 蛋白C346 和F2 蛋白C80 兩個半胱氨酸連接[17]。本研究中的3株APMV-4 毒株的F 蛋白裂解位點序列為116DIPQR ↓F121，與新城疫弱毒株裂解位點較為相近[18]。此外，F1 蛋白在第260 位以及第455 位存在兩個高度保守的糖基化位點，F2 蛋白也存在一個糖基化位點，位于第89 位，同時F1 蛋白中還存在2 個疏水性七肽重復序列，分別為HRa（142～193）和HRb（469～500）。3株APMV-4 毒株的F 蛋白糖基化位點與我國香港、韓國分離株對比并未發現突變，且七肽重復區均一致。APMV-4 的HN 蛋白是一種 II型整合膜蛋白，在第11、58、141、317 和448 位分別存在5 個潛在的糖基化位點[14]，而這3株毒株的HN 蛋白糖基化位點和229～234 位的唾液酸受體結合基序（NRKSCS）未發生變異。本研究系統分析了我國3株APMV-4 鴨源分離株的生物學特性和基因組特性，為進一步了解APMV-4 和科學防控APMV-4感染提供了參考數據。