云南省某養雞場鼻氣管鳥桿菌核酸檢測及其16S rDNA 基因序列分析

胡 騎，張振興，宋建領

（云南省畜牧獸醫科學院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224）

鼻氣管鳥桿菌病是由鼻氣管鳥桿菌（Ornithobacterium rhinotracheale，ORT）引起禽類的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病，雞和火雞易感。該病以呼吸困難、生長障礙及嚴重的纖維素性化膿性肺炎和氣囊炎為特征。ORT 常與禽流感病毒（AIV）、大腸桿菌、傳染性鼻氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）等病原混合或繼發感染，導致感染雞群生長緩慢，死亡率增加，給養禽業造成巨大經濟損失[1-2]。該病原1981 年由德國學者發現，1994 年比利時學者建議使用“鼻氣管鳥桿菌”這個術語，之后在美國、德國、英國、法國、以色列、荷蘭、南非等許多國家被發現[3]。2000年陳小玲等[4]在我國首次分離到ORT。泰國、伊朗以及我國臺灣地區進行流行病學和血清型調查，發現ORT 陽性率很高。目前該病分布廣泛，可能呈世界性蔓延[5]。本研究對云南省易門縣某養雞場能導致相似臨床癥狀的相關病原進行核酸檢測，證實病原為ORT，經16S rDNA 基因序列分析，發現病原變異較少，這對于指導該地區雞群細菌病防控具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2020 年12 月初，云南省易門縣某養雞場出現大量流鼻涕、打噴嚏、面部腫脹、食欲下降和生長緩慢等癥狀的雞只。12 月9 日，取病死肉雞鼻腔黏液及肺、氣管等組織，混合剪碎研磨，按照體積比1:10 加入PBS，反復凍融3 次后，3 000 r/min 離心10 min，取上清液提取核酸。

1.1.2 試劑 RNA/DNA 核酸提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0，膠回收試劑盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0，PCR 試劑盒PremixTaq（TaKaRaTaqVersion 2.0 plus dye），RT-PCR 試劑盒PrimeScript Onestep RT-PCR Kit Ver.2，均為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 按照RNA/DNA 核酸提取試劑盒說明書，提取組織上清液核酸。

1.2.2 引物合成 根據國內外已發表的ORT、ILTV、AIV、雞副嗜血桿菌（ICV）基因序列及相關文獻[6]，分別設計檢測引物，檢測能引起肉雞呼吸道癥狀的上述常見病原核酸。引物序列信息見表1。

表1 病原核酸檢測引物序列

1.2.3 病原核酸檢測 通過RT-PCR/PCR 方法分別檢測AIV、ILTV、ORT、ICV 核酸。AIV 的RT-PCR 擴增體系（25.0 μL）：2×1 Step Buffer 12.5 μL、RNase Free dH2O 8.5 μL、上游引物（AIV-F）0.5 μL、下游引物（AIV-R）0.5 μL、Prime Script 1 Step Enzyme Mix 1.0 μL、模板RNA 2.0 μL。RTPCR 擴增程序：50 ℃反轉錄30 min；94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環；72 ℃延伸7 min。其他各病原（ILTV、ORT、ICV）的PCR 擴增體系（25.0 μL）：rTaq12.5 μL，RNase Free dH2O 9.5 μL，病原的上、下游引物均為0.5 μL，模板DNA 2.0 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個循環；72 ℃延伸7 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，觀察結果。

1.2.4 16S rDNA 核苷酸序列分析 將PCR 檢測陽性樣品產物，用膠回收試劑盒進行DNA 回收后，送昆明擎科生物公司測序；采用MEGA 11 軟件，對16S rDNA 進行序列比對和系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 病原核酸檢測

在采集的鼻腔黏液以及肺、氣管等組織樣品中檢出ORT 核酸陽性，而ILTV、AIV 和ICV 均為陰性（圖1）。

2.2 16S rDNA 基因序列分析

通過BLAST 比較后，自GenBank 數據庫中下載國內外公開的ORT 16S rDNA 基因序列和同源性高的ORT 16S rDNA 基因序列，采用MEGA 11軟件進行序列比對和系統發育分析。ORT 陽性樣品16S rDNA 基因與ORT14/16株、CH-P940508株的同源性均為99.9%，與土耳其/匈牙利1997株、土耳其/匈牙利2009株及ESV60、ESV207株的同源性均為99.7%（圖2）。系統進化分析結果顯示：ORT 陽性樣品16S rDNA 基因與ORT14/16株、CH-P940508株、土耳其/匈牙利1997株和土耳其/匈牙利2009株在同一個分支內，均屬于基因群I型（圖3）。

3 討論

禽鼻氣管鳥桿菌病在全球范圍內流行，目前呈快速蔓延趨勢[7]。其易感動物種類繁多，尤以禽類最為易感，禽類感染后主要表現流鼻涕、呼吸紊亂等呼吸道癥狀，以及生長遲緩、采食量及肉增重減少、蛋雞產蛋量降低等。在本研究案例中，臨床剖檢發現病雞的肺、氣管均出現腫脹、充血以及鼻腔黏液增多等明顯炎癥情況，與文獻[8-10]報道的該病病理變化多見氣囊炎、單側或雙側纖維素性化膿性肺炎、胸膜炎等一致。目前，ORT 的病原學及其感染的防控技術等研究還不夠深入。由于ORT 血清型眾多，且常與其他細菌或病毒發生混合感染，因此有必要深入研究ORT 的致病機理，進一步探究該病的防治策略。

全長16S rDNA 核苷酸同源性和系統進化關系顯示，本次從云南省檢出的ORT 陽性樣品與6株英國分離株LMG 的同源性相差較大，但與伊朗分離株（ORT8/15、ORT14/16）和土耳其/匈牙利分離株（OR006/turkey/Hungary/2009、OR035/turkey/Hungary/1997）的同源性均在99.7%以上，都處于同一分支內，與李富祥等[11]2014 年報道的情況一致，說明云南省雞源ORT 在過去8 年內突變較少。

ORT 單獨感染時危害不大，死亡率也不高，臨床癥狀較輕微，容易被養殖者忽視，導致后期發生混合感染，病程延長，用藥治療效果差，危害加大。目前國內對ORT 重視程度有待加強，病原研究不夠充分，也沒有相應疫苗可用，建議做好生物安全措施，減少各類應激，加強飼養管理，防止家禽發病，從而減少經濟損失。云南省是全國重要的養雞大省，2021 年全省出欄肉雞3 億只以上，絕大部分為大型集約化養殖，規模化養雞場的ORT 檢出率為20%[7]，推算全省約有6 000 萬只雞感染，一旦發病，可能造成難以估量的經濟損失。故建議家禽養殖企業在重視傳染性和致死性巨大的禽流感、新城疫、馬立克氏病等病毒病的同時，重視細菌病給生產帶來的影響。