浙江省寧波市大黃魚病原菌分離鑒定及其耐藥性分析

葛明峰，金晗，柳海，徐勝威，許昊川，王雯瓊，沈偉良

（1.寧波市海洋與漁業研究院，浙江寧波 315000；2.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連 116023）

我國大黃魚（Pseudosciaena crocea）養殖產業的發展，帶動了飼料、交通運輸、餐飲服務等相關上下游產業，創造了巨大的社會和經濟效益。但隨養殖量的攀升，受養殖密度增大，以及水體負載飽和及污染加重，管理水平低和技術規范欠科學等諸多因素影響，養殖大黃魚病害頻發，且呈日益加重趨勢[1-2]。

據漁業年鑒統計，我國2020 年大黃魚養殖產量達25.4 萬t，為海水養殖魚類第一，而因病害造成的經濟損失約為5.0 億元，其中由細菌性疾病造成的危害最為嚴重[3-4]。對大黃魚細菌性病害進行監測，不僅能夠較系統地掌握細菌病害的發生規律、分布及其程度等，更能及時、有效地預防與控制細菌病害，將其所造成的損失降到最低[5]。

同時，為推進農業農村部關于實施2021 年水產綠色健康養殖“五大行動”，達到用藥減量的目的，對分離的病原菌進行了藥敏試驗，以掌握其對不同漁藥的耐藥性及其變化規律，豐富當地及全國大黃魚養殖區域病原菌耐藥譜庫，為科學、規范、精準、合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品

2021 年4—10 月，每月在象山西滬港、三門灣大黃魚網箱養殖海區進行1 次例行采樣檢測，并同時對寧波市其他大黃魚養殖場，如發生細菌性疾病的場進行應急采樣檢測。每次每個養殖點現場采集臨床癥狀明顯的活體或瀕臨死亡的個體5～10 尾，共采集大黃魚93 尾。

1.2 主要試劑與材料

牛腦心浸出液固體培養基，青島海博生物技術有限公司產品；DNA 提取試劑盒，Omega Biotek 公司產品；2×TaqMasterMix（含染料），Takara Bio 公司產品；16S rDNA 引物，由北京華大基因科技有限公司合成；藥敏檢測分析試劑盒、試劑板，南京菲恩醫療科技有限公司產品。

1.3 細菌分離與鑒定

無菌條件下，取魚肝、脾、腎等組織劃線接種于牛腦心浸出液固體平板，28 ℃培養24～48 h（鰤魚諾卡氏菌需培養5～7 d）；挑取單菌落純化培養后，提取細菌DNA。根據16S rDNA 序列設計引物，建立PCR 擴增體系[6]。PCR 產物測序結果由北京六合華大基因科技股份有限公司提供，經GenBank Blast 數據比對后進行細菌鑒定。

1.4 藥敏試驗

根據全國水產技術推廣總站關于水產養殖主要病原微生物耐藥性普查工作要求，選定硫酸新霉素、鹽酸多西環素、甲砜霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶、“磺胺甲噁唑+甲氧芐啶”等8 種抗菌藥物。根據藥敏檢測分析試劑盒、試劑板操作說明，得到各藥物對菌株的最低抑菌質量濃度（MIC），計算中位值MIC50，然后進行分析比較。

2 結果與分析

2.1 細菌分離

2.1.1 細菌種類 2021 年1—10 月從采集的93 尾大黃魚中分離到6 種細菌，共25株（表1）。其中：殺香魚假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）8株，占總菌株數的32%（8/25）；三類弧菌10株，包括溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）各4株，副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）2株，占總分離菌數的40%（10/25）；另有5株鰤魚諾卡氏菌（Nocardia seriolea）和2株美人魚發光桿菌（Photobacterium），占比分別為20%（5/25）和8%（2/25）。這25株菌株從象山地區分離到20株（西滬港13株、三門灣7株），鄞州和奉化地區各分離到2株，寧海分離到1株。

表1 2021 年1—10 月分離到的細菌種類及數量 單位：株

2.1.2 分離地點與時間 共分離到殺香魚假單胞菌8株，其中1 月（水溫21 ℃）于鄞州區室內水泥池發病大黃魚上分離到2株，4—5 月在象山網箱養殖大黃魚上陸續分離到6株（4 月、5 月西滬港各2株，三門灣各1株），發病水溫普遍為18～22 ℃。分離到弧菌10株（奉化、象山西滬港、三門灣分別2株、5株、3株），其中溶藻弧菌4株、哈維氏弧菌4株、副溶血弧菌2株，且采樣時間集中在5、7、8 月。5 月，從象山西滬港同一批魚組織上不僅分離到1株溶藻弧菌，同時還分離到2株美人魚發光桿菌，表現為混合感染。8—10 月，共分離到5株鰤魚諾卡氏菌，其中8—9 月從寧海、象山地區各分離到2株，10 月從象山西滬港分離到1株。

2.2 細菌耐藥性分析

2.2.1 不同病原菌對藥物的耐藥性 通過統計MIC50得到的結果見表2。分析可知，殺香魚假單胞菌的耐藥性普遍大于其他5 種細菌，特別是對酰胺醇類（甲砜霉素、氟苯尼考）及磺胺類藥物（磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑+甲氧芐啶）的MIC50高于其他病原菌。3 種弧菌對不同藥物的耐藥性基本一致，除對恩諾沙星和甲砜霉素略有差異外，對其他6 種藥物的MIC50則完全相同，且與其他3 種病原菌相比，弧菌對藥物的敏感性更強。美人魚發光桿菌和鰤魚諾卡氏菌都對鹽酸多西環素最為敏感，與3 種弧菌的耐藥性類似。從抗菌藥物種類分析，2 種磺胺類藥物對不同病原菌的抑制作用較強（殺香魚假單胞菌除外），鹽酸多西環素和氟甲喹對溶藻弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、美人魚發光桿菌及鰤魚諾卡氏菌都有極好的抑制作用，除氟甲喹對美人魚發光桿菌MIC50為4.00 mg/L 外，這兩種藥物對5 種菌的MIC50均小于最低試驗藥物質量濃度。另外，恩諾沙星、硫酸新霉素的抑菌效果也普遍較好，MIC50為0.13～4.00 mg/L；而酰胺醇類的甲砜霉素、氟苯尼考抑菌效果一般，尤其是對殺香魚假單胞菌的MIC50≥200 mg/L。

表2 各病原菌對不同藥物的耐藥性（MIC50） 單位：mg/L

2.2.2 同種病原菌對藥物的耐藥性 對不同采樣時間、不同養殖地區大黃魚上分離到的殺香魚假單胞菌進行藥敏試驗，結果發現各菌株對同一藥物的耐藥性并不完全一致（表3）。除了磺胺間甲氧嘧啶和“磺胺甲噁唑+甲氧芐啶”這2 種藥物對4株病原菌的MIC 相同外，其他6 種藥物對不同時間分離到的殺香魚假單胞菌的抑菌效果均有一定差異。其中，5 月16 日從象山三門灣分離的菌株對氟甲喹的敏感性高于其他株菌；1 月15 日從鄞州室內水泥池養殖大黃魚上分到的菌株對恩諾沙星敏感性高于其他株菌。總體而言，4 月2 日從象山西滬港網箱養殖魚體上分離到的殺香魚假單胞菌對8種藥物的耐受性普遍高于其他3 個菌株。這表明從不同時間、不同地區、不同養殖模式大黃魚上分離到的殺香魚假單胞菌對藥物的耐藥性存在一定差異。

表3 不同時間分離到的殺香魚假單胞菌對不同藥物的耐藥性（MIC50） 單位：mg/L

3 討論

細菌病一直是困擾大黃魚健康養殖的一類疾病，其中以弧菌病（皮膚潰瘍病）居多，危害最大[7]。李清祿等[8]對引起福建省網箱養殖大黃魚弧菌病的病原菌鑒定為鰻弧菌和副溶血弧菌，且鰻弧菌占51%。這與本研究結果有一定差異，本研究未分離到鰻弧菌，這可能跟福建省區域的水溫、鹽度較寧波市高等環境差異導致水體中優勢菌群不同有關。殺香魚假單胞菌是引起寧波市大黃魚內臟白點病的主要病原[9-10]。有研究[11-13]對寧德市大黃魚內臟白點病進行了流行病學調查，發現致病菌也為假單胞菌屬細菌。本次調查發現，從象山西滬港魚體上分離到的菌株數及細菌種類均高于三門灣。這可能跟兩者所處地理位置有關，三門灣更靠近象山港口，水流速度快，且該區域養殖密度低，養殖環境整體優于西滬港，因而細菌感染及疾病的發生都較后者低。

大黃魚細菌病流行時間大多在4—10 月，其中5—9 月為流行高峰期[7]。從不同病原菌的分離時間分析，4—5 月是大黃魚內臟白點病的高發期，隨著水溫升高，該病有所緩減。5—8 月由于梅雨、高溫等惡劣天氣影響，且隨著水溫上升，細菌迅速繁殖，水質加劇惡化，易發生弧菌病等多種細菌疾病。如這一時期分離到的美人魚發光桿菌和3 種弧菌，都是海水中常見的條件致病菌[14-15]，其感染魚體的主要原因是目前網箱養殖集約化程度高，養殖密度大，導致魚體容易損傷，免疫力下降。本次調查在6 月未分離到任何菌株，推測可能跟5 月細菌集中感染后養殖戶注重水體消毒并內服抗生素等積極的防控措施有關，亦或跟采樣點的局限性有關。8—10 月為大黃魚諾卡氏菌病發病高峰期，該菌從2006 年在網箱養殖大黃魚被發現后[16-17]，便一直危害魚體，尤其近幾年對寧波市大黃魚養殖造成了較為嚴重影響，雖然日死亡量不大，但影響時間長。由上述分析可知，大黃魚細菌性疾病的發生種類與水溫存在一定的相關性。另有研究[18]表明，福建省等大黃魚養殖地區也時常發生上述疾病，但流行時間略有差異，如內臟白點病在寧德市的發病期往往為11 月至次年5 月，而寧波市11 月至次年2 月很少發現該病。這主要跟水溫有關，該時期寧波市水溫較低，養殖戶往往將大黃魚運往溫州、福建等水溫較高的地區越冬。

從細菌耐藥性結果可知，鹽酸多西環素、氟甲喹、恩諾沙星對大部分病原菌的抑制效果較好，可作為防治大黃魚細菌病的首選藥物。但考慮到寧波市養殖區域鹽酸多西環素及恩諾沙星使用較普遍且頻繁，建議養殖戶可用氟甲喹替代，實行輪換用藥，以避免細菌產生耐藥性[19]。磺胺類藥物與增效劑甲氧芐啶合用療效更佳[5]。病原菌對磺胺類藥物的MIC50較前幾年大幅下降，這可能是由于近幾年寧波市大黃魚養殖區域較少使用磺胺類藥物，亦或與菌株耐藥性的自然消失有關，但對該類藥物敏感性還需持續跟蹤監測，以準確掌握其變化規律。另外，不同時間、不同地區魚體上分離到的殺香魚假單胞菌對藥物的耐藥性并非完全一致，這可能跟菌種存在不同亞種以及各養殖地區用藥狀況有關。因此即使針對同種細菌，在藥物選擇及劑量上也應參考藥敏試驗結果而定，不可僅憑經驗或照搬書本[20]。但要指出的是，MIC50雖然是評價病原菌對抗菌藥物敏感性的主要指標，是選擇有效抗菌藥物的重要依據，但體外試驗與魚體內環境還存在一定差異。因此，要制訂有效的治療方案，達到最佳的療效，還應結合藥代動力學、藥效學等參數。

病原菌耐藥性監測對科學精準用藥，推動水產綠色健康養殖及用藥減量具有十分重要的意義。之前關于大黃魚細菌耐藥性的分析大多集中于福建省寧德市[21-22]，而本研究進一步豐富了大黃魚病原菌耐藥性的基礎數據，擴大了耐藥性譜庫，有利于在相關疾病發生時做出快速判斷并采用相應的藥物進行防控，避免亂用、濫用藥物，從而降低病原微生物耐藥性。同時，養殖戶還應嚴格遵守《水產養殖用藥明白紙》（2020 年1、2 號）相關規定，并嚴格執行休藥期制度，避免魚體藥物殘留超標，保障水產品質量安全。