皂苷作為疫苗免疫佐劑的研究進展

孫超鈺，劉燕華，李扛，戴書通，李銘東

（江西中醫藥大學藥學院，江西南昌 330004）

隨著現代社會的發展，醫療技術突飛猛進，催生出許多先進的醫療手段，疫苗就是科技發展的代表性產物之一。疫苗是將病原微生物及其代謝產物，經過人工減毒、滅活或利用轉基因等方法，制成用于預防傳染病的自動免疫制劑[1]。由于滅活疫苗的抗原免疫原性較弱，單獨使用往往達不到有效的免疫強度，必須在抗原中添加佐劑，從而輔助提升免疫應答強度[2]。佐劑是指與抗原同時或預先使用，能增強機體針對抗原的免疫應答能力或改變免疫反應類型的一類物質，在疫苗中發揮輔助或者輔佐作用[3]，在20 世紀早期就被使用到臨床。目前臨床常用的佐劑有鋁佐劑、多糖佐劑、細胞因子佐劑、皂苷佐劑等，并不斷有AS01、AS04 等復合佐劑被開發出來。鋁佐劑是指以氫氧化鋁等鋁鹽為主要成分的佐劑，因具有較好的吸附能力而成為廣泛使用的佐劑之一。它不僅能夠增強免疫反應，而且還能激活樹突狀細胞和補體，促進抗原的提呈，但是副作用較大，因此不斷提高鋁佐劑的安全性是開發新型鋁鹽佐劑的趨勢之一。多糖是自然界普遍存在的一類結構多樣的生物大分子[4]。我國首個以多糖為佐劑的疫苗——13 價肺炎球菌多糖結合疫苗于2020 年獲批上市。該疫苗使用肺炎球菌莢膜多糖偶聯載體蛋白形成免疫復合物，用以預防肺炎球菌引起的疾病。研究[5]表明，多糖作為疫苗佐劑，毒性低、安全性高且免疫反應迅速，具有較大的發展空間。細胞因子是一大類水溶性小分子多肽或蛋白質[6]，多屬于內源性物質，種類多樣，生物相容性高，作為免疫佐劑可獲得更強的免疫調節效果。

皂苷是一類廣泛存在于植物中的糖苷類化合物。皂苷佐劑開始進入研究者的視野，源于從南美皂樹中提取到的一種皂樹皂苷，其既能刺激Th1型免疫應答，又能誘導細胞毒性T 淋巴細胞應答，具有高佐劑活性。皂苷主要來源于植物，作為天然產物，它自身具有一定的免疫反應活性，不僅能減少疫苗接種次數，延長作用時間，還能通過減少抗原用量從而提升疫苗的安全性，這也是皂苷佐劑低毒、高效的依據。雖然皂苷優勢明顯，但仍存在溶血性、細胞毒性等弊端，要想將皂苷逐步應用到疫苗中還需更多的臨床研究。目前只有極少數皂苷佐劑獲批上市，美國食品藥品監督管理局2017 年批準了一種帶狀皰疹疫苗Shingrix?[7]。該疫苗的佐劑名為AS01，成分是QS-21 皂苷和單磷脂酰A。本文將重點論述皂苷作為疫苗佐劑的研究進展，以期為開發新型疫苗佐劑提供參考。

1 皂苷作為疫苗佐劑的作用機制

目前皂苷類佐劑研究中以三萜皂苷類為主。三萜類皂苷在自然界分布廣泛，其基本結構是不同的苷元母核上連接不同的糖基。三萜皂苷多按其苷元中30 個碳組成環的數目多少，分為四環三萜皂苷和五環三萜皂苷，其中四環三萜皂苷有人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1 等，五環三萜皂苷有柴胡皂苷A、柴胡皂苷D 等。不同結構的皂苷不僅具有不同的藥理作用，其作為佐劑使用時的作用機制也可能不同。

皂苷作為疫苗佐劑，在進入機體后會誘導各種免疫相關細胞的分化成熟，比如中性粒細胞的富集，誘導細胞因子的產生，以及巨噬細胞和樹突狀細胞（DC）[8]的分化成熟。劉永華等[9]研究人參皂苷Rg3 單體對體外培養的DC 分化、成熟及對免疫功能的影響，結果發現人參皂苷Rg3 可誘導DC 分化和成熟，并通過促進DC 分泌IL-12 來促進T/NK 細胞的增殖和活化，從而達到增強機體免疫功能的作用。研究[10]表明，皂苷還能有效刺激Th1型免疫應答并產生特異性細胞毒性T 淋巴細胞。Lacaille-dubois[8]研究發現，QS-21 可誘導Th1型免疫應答反應，從而有助于保護機體免受許多病原體的侵害。Th1型CD4+T 細胞主要釋放促炎細胞因子白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），它們直接或間接地通過CD8+T 細胞激活和分化各種細胞因子以及產生IgG2a 和IgG3，參與清除細胞內病原體。

皂苷能有效增強疫苗的免疫原性是基于皂苷在注射部位具有“倉庫效應”，緩慢釋放，持久起效，而且還會上調相關免疫基因mRNA 的表達，促進細胞因子和趨化因子的分泌[11]。Nilgun 等[12]研究了黃芪甲苷VII（AST-VII）與不同免疫刺激劑配伍使用后的免疫效果，發現AST-VII 在活疫苗或者滅活疫苗中均能夠誘導產生特異性的IgG、IgG1 和IgG2b 抗體應答以及IL-2 和IL-4。當黃芪甲苷VII 與黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）配伍使用時，產生的中和抗體增多，并輕微增加IFN-γ 和IL-2 的水平。Sun 等[13]評估了合歡皂苷活性成分（albizia julibrissin saponin active fraction，AJSAF）對小鼠和雞免疫滅活H9N2 禽流感疫苗的免疫應答作用，發現AJSAF 可顯著誘導免疫小鼠脾細胞產生Th1（IL-2 和IFN-γ）和Th2（IL-10）細胞因子，并上調Th1 和Th2 細胞因子及轉錄因子的mRNA 表達水平，從而達到提升體液免疫和細胞免疫的免疫強度，增強疫苗免疫應答的目的。

2 皂苷作為疫苗佐劑的優缺點

2.1 皂苷佐劑的優點

主要包括：①植物來源廣泛，且安全性較高；②自身具有一定的免疫應答作用；③參與調節固有免疫細胞（比如中性粒細胞、樹突狀細胞等），使其產生非特異性免疫；④上調各種免疫相關因子的基因表達。

三七總皂苷（PNS）是從我國傳統中藥三七中提取得到的主要活性成分，包含多種單體。陳毓等[14]研究了PNS 的溶血性和體外免疫活性，發現PNS 在0.25 mg/mL 以下時無溶血性，在125 μg/mL 以下時對脾淋巴細胞活力未有抑制作用，顯示出較好的安全性；在一定濃度范圍內，PNS 對體外誘導的T 淋巴細胞和B 淋巴細胞增殖有極顯著促進作用，具有作為免疫佐劑的潛力。Jing 等[15]對肌肉注射卵清蛋白和禽流感疫苗（rLH5）以及AJSAF 小鼠的股四頭肌進行了基因芯片分析，發現AJSAF 主要誘導“中性粒細胞”CCL2、CXCL1、CXCL5、IL-1β、IL-6、IL-33、S100A8和S100A9基因的表達，在注射部位誘導細胞因子產生以及中性粒細胞富集，從而增強機體免疫反應。王敏等[16]研究了黃芪皂苷Ⅱ（ASI Ⅱ）通過調控CD45 蛋白酪氨酸磷酸酯酶（CD45 PTPase）誘導抗腫瘤免疫的效應。ASI Ⅱ給藥腫瘤模型小鼠后，明顯提高了該類小鼠T 淋巴細胞增殖，而且小鼠脾淋巴細胞Th1 細胞因子（IL-2 和IFN-γ）和Th2細胞因子（IL-4）mRNA 表達水平顯著提升，表明ASI Ⅱ不僅能提高小鼠的免疫功能，還具有一定的抗腫瘤免疫反應。朱洪卿等[17]研究了裂果薯總皂苷（SSPHs）對H22 荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用及其機制，發現SSPHs 抑制腫瘤效率能達到61.70%，并且可顯著提高荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α 的水平；在免疫組化試驗中發現，SSPHs 可使腫瘤組織中的CD4+T、CD8+T 細胞表達增加。這些研究結果表明，SSPHs 可通過上調細胞因子和CD4+T、CD8+T 細胞的表達抑制腫瘤生長，提高抗腫瘤免疫，從而增強機體免疫活性。

2.2 皂苷佐劑的缺點

主要包括：①溶血性；②細胞毒性；③神經毒性；④增加腸道通透性；⑤損害肝臟和腎臟。

孫雨晴等[18]探討了七葉皂苷鈉（七葉皂苷Ia、七葉皂苷Ib、異七葉皂苷Ia 和異七葉皂苷Ib的混合物）對腎細胞的影響，結果發現4 種七葉皂苷異構體均能直接結合到熱休克蛋白的ATP 結合域，抑制熱休克蛋白發揮應激保護功能，并下調其表達水平。由于熱休克蛋白是一類對腎損傷有保護作用的應激蛋白，因此抑制其應激保護功能可能會導致腎損傷。Zhang 等[19]評價了藜麥粗皂苷的安全性，并研究了藜麥粗皂苷對大鼠腸道微生物的影響。結果顯示，口服皂苷以后，雌雄大鼠出現不同種的差異代謝物，代謝組學發生改變，而且大鼠腸道菌群增加，腸道黏膜出現不同程度壞死。這與皂苷刺激腸道上皮細胞改變其黏膜結構導致腸道損傷有關。王文平[20]深入研究了重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潛在毒性及其作用機制，發現這3 種單體可明顯殺死所選的肝細胞和腎細胞以及多數的心臟細胞，具有明顯的細胞毒性，其作用機制主要是誘導細胞凋亡和抑制血管新生；動物試驗發現，重樓皂苷Ⅰ毒性最強，而且進一步驗證了其心臟和肝臟毒性，并推測重樓皂苷Ⅰ誘導的肝毒性機制是CYP450 酶和脂質代謝介導的線粒體功能障礙為主體的肝細胞損傷。

眾所周知，皂苷具有溶血性。隨著科學技術的發展，皂苷的溶血性和細胞毒性可以通過一定的技術手段避免或降低。Samuel 等[21]將巴西藜蘆皂苷（QB-80）包裹在脂質中制成納米佐劑（IMXQB-80），經毒性試驗發現，IMXQB-80 可降低細胞毒性，而且比QB-80 皂苷誘導等效刺激所需的皂苷少4 倍，說明其毒性更低，效果更好。

2.3 皂苷佐劑與其他常見佐劑的比較

皂苷佐劑與其他常見佐劑相比各有利弊（表1），可以采取各種手段擴大優勢或者削弱弊端，使其應用更加安全和廣泛。

表1 不同類型佐劑主要優缺點比較

3 皂苷作為疫苗佐劑的應用

3.1 在人用疫苗中的應用

人用疫苗主要針對人類易感傳染病所設計，安全性要求極高，從研發、生產到臨床，都有嚴格的質量把控。人用疫苗中比較傳統、常見的類型是滅活疫苗和減毒活疫苗，如流感疫苗、甲肝疫苗、乙肝疫苗等。滅活疫苗是將微生物采用適當的方式滅活，使其不具感染性，但保留免疫原性，并與相應的佐劑按一定比例混合后制成的[24]。減毒活疫苗是指將病原體處理后，使其結構發生變化，毒性顯著降低，但活性保持不變，并能保持原有抗原性的疫苗。有些疫苗既能制成滅活疫苗，又能制成減毒疫苗。滅活疫苗和減毒活疫苗的免疫原性較弱，通常都需要在疫苗制劑中添加佐劑，以增強疫苗的免疫活性。目前皂苷佐劑的研究主要集中在抗病毒和抗腫瘤疫苗佐劑上，而在一些常見的人用疫苗，如甲肝疫苗、乙肝疫苗、狂犬病疫苗等的研究中卻較為少見。

由流感病毒導致的流感每到冬季就進入高發期，老人和孩子因免疫力低下而成為流感的高發人群，而接種疫苗是預防流感的一種有效手段。流感疫苗接種周期短，免疫時間長，因而需要添加免疫佐劑。Buzz 等[25]評估了新型半合成皂苷TQL1055增強流感抗原免疫原性的潛力，并與QS-21 進行了對比，結果發現TQL1055 對流感抗原具有較強的輔助活性，而且具有減少抗原劑量和較好的全身耐受性等特點。該研究進一步支持皂苷在流感疫苗方面具有較好的佐劑活性和更大的發展潛力。為了研究流感疫苗對老年人的保護力，Vassilieva 等[26]建造了老齡小鼠模型，把2′,3′-環鳥苷單磷酸腺苷（cGAMP）與皂苷佐劑結合，然后與亞單位流感疫苗聯合應用，結果發現皂苷與cGAMP 聯合使用可以提高流感疫苗對老年人群的免疫效力，而無需增加劑量或進行額外接種。

宮頸癌是一種多發于育齡女性的疾病，而99.6%的宮頸癌因HPV 感染引起。HPV 疫苗常見的是二價、四價和九價，后兩者我國目前仍主要依靠進口。皂苷在HPV 疫苗中的研究相對較少，但是已有研究結果表明皂苷對于宮頸癌具有一定的治療作用。高孟等[27]選擇5 種具有免疫調節功能的人參皂苷單體，比較了它們對治療性HPV16 重組疫苗免疫效果的影響，發現人參皂苷Rg1 和Rb1可顯著提高HPV16 重組疫苗的特異性細胞免疫應答，具有作為治療性HPV16 重組疫苗佐劑的潛力。

肺癌是我國臨床常見惡性疾病，其患病率和死亡率均居所有惡性疾病前列，而非小細胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌病人的80%[28]。譚先勝等[29]研究了絞股藍皂苷（XLIL）上調可溶性Tim-3（sTim-3）和黏蛋白域3（Tim-3）的比率在NSCLC 細胞免疫逃逸中的作用機制。在NSCLC組中可以觀測到，ADAM-10/17 水平和sTim-3表達水平明顯下降，Tim-3 表達水平明顯上升，ADAM-10/17可以分解Tim-3 得到sTim-3，而sTim-3 具有抑制腫瘤免疫逃逸的作用；與對照組相比，添加XLIL 的腫瘤細胞，無論低、中、高劑量，sTim-3 和Tim-3 的比值均上調，不僅腫瘤細胞的增殖活性和侵襲率顯著降低，而且腫瘤細胞中免疫分子IFN-γ 和TNF-α 的表達水平也明顯下調。上述研究結果表明，絞股藍皂苷能夠減少NSCLC細胞的免疫逃逸，這也說明其有作為抗NSCLC 疫苗佐劑的潛力。

3.2 在獸用疫苗中的應用

獸用疫苗主要針對動物出現大規模傳染病而設計的，對于養殖生產、生態保護等具有重要意義。許多動物一旦染病就會出現大面積死亡，如果提前注射疫苗預防，將會大大降低養殖戶的經濟損失。獸用疫苗的安全性沒有人用疫苗要求那么苛刻，其發展遠快于人用疫苗。獸用疫苗的分類與人用疫苗大體相似，主要包括常規疫苗和基因工程疫苗。常規疫苗主要指滅活疫苗和減毒活疫苗，而基因工程疫苗包括亞單位疫苗、基因缺失苗、載體疫苗、核酸疫苗等。因皂苷能夠刺激免疫反應，因此被廣泛應用于動物疫苗中，其中應用最廣的是Quil-A。Quil-A 是一種非均相混合物，毒性較強，雖不適用于人類疫苗，但被廣泛用于獸用疫苗[30]。皂苷在獸用疫苗方面的研究較多，基于動物易感染各種病毒而致病，相關研究也主要集中在抗病毒方面。

馬立克氏病（Marek′s disease，MD）是由馬立克氏病病毒（Marek′s disease virus，MDV）引起雞的一種高度接觸性傳染性腫瘤疾病[31]，通常導致養雞業30%以內的損失，有的可達50%。盡管該病可以用疫苗預防，但隨著毒性極強變異毒株的產生，該病的疫苗免疫效果也隨之減弱，需要更加有效的疫苗，因此佐劑的選擇更加重要。研究發現，meq基因是MDV 致瘤相關基因之一，而L-meq 蛋白可能是該基因的轉錄抑制子。付本懂等[32]、王帥玉等[33]研究了不同濃度的人參總皂苷對L-meq基因mRNA 水平的影響，發現人參總皂苷會通過提高L-meq基因的含量而抑制meq基因的相關轉錄，從而誘導MD 腫瘤細胞系——MSB-1 細胞的凋亡；后續研究發現，人參總皂苷中的人參皂苷Rh2體外能夠抑制MSB-1 細胞的增殖。人參皂苷不僅能增強疫苗的免疫原性，還有一定的腫瘤抑制作用，可見其具有作為MD 疫苗佐劑的潛力。

H5N1 亞型禽流感是一種人獸共患病，不僅對雞鴨鵝等家禽的致死率可達100%，造成家禽業嚴重損失和危害，而且對人類也具有致病性。HA 蛋白是H5N1 禽流感病毒粒子中最豐富的糖蛋白之一。研究表明，HA 蛋白抑制劑在病毒感染早期可以阻斷病毒入侵，有效對抗H5N1 禽流感病毒。石婉真[34]研究了薯蕷皂苷類化合物對H5N1 禽流感病毒包膜蛋白HA 的活性影響，發現天然產物馬鈴薯三糖薯蕷皂苷 chlorogenin 3-O-β-chacotrioside 的結構類似物XC-27 能在體外有效抑制H5N1 亞型禽流感病毒HA 蛋白復制，且對多種毒株敏感。研究者以XC-27 為基礎設計合成了兩個薯蕷皂苷類化合物XC-27-1 和XC-27-2，試驗發現兩個化合物在預防模式下對 H5N1 亞型禽流感病毒都有較強的抑制作用，說明其可以在細胞染毒的早期階段，抑制H5N1 亞型禽流感病毒入侵。薯蕷皂苷類化合物若作為佐劑使用，也許會使H5N1 亞型禽流感疫苗覆蓋更多的變異毒株。

巖鯛虹彩病毒（RBIV）會感染巖鯛，導致其脾細胞異常增大，最終導致整個魚類種群死亡，對巖鯛養殖造成嚴重威脅。Jung 等[35]研究了添加角鯊烯、氫氧化鋁和皂苷的滅活RBIV 疫苗的安全性和潛力。研究結果顯示，3 種佐劑均能增強滅活病毒抗原的免疫原性，但只有皂苷不會引起任何明顯的副作用，在添加皂苷的RBIV 疫苗組中，IL-1β、Mx、PKR 的轉錄水平顯著提高，表明基于皂苷佐劑的RBIV 滅活疫苗可以為巖鯛提供針對該病毒的保護性免疫。

白景英等[36]對比了絞股藍皂苷（GP）和經過磷酸化修飾的絞股藍皂苷（pGP）體外抗鴨肝炎病毒（DHAV）的作用。試驗結果表明，GP 和pGP均具有體外抗DHAV 作用；對DHAV 的基因序列測定發現，在病毒的吸附、復制、釋放階段，兩種皂苷均對其有顯著的抑制作用，而且pGP 效果要優于GP。研究結果表明，磷酸化修飾顯著提高了GP 的抗DHAV 作用，因此pGP 有成為抗DHAV疫苗佐劑的潛力。

Wasin 等[37]研究了皂苷Quil A 與豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV-1）改性活病毒（MLV）疫苗共同給藥，對IL-Ⅰ、IL-Ⅱ以及炎性細胞因子基因表達的影響。對于免疫后接種PRRSV-1 MLV 疫苗的小組，PRRSV 病毒血癥豬的數量顯著降低，平均日增重顯著提高；對于皂苷Quil A 和PRRSV-1 MLV 疫苗共同給藥的小組，干擾素調節因子3,2′-5′-寡腺苷合成酶1、IFNα、IFNβ、腫瘤壞死因子α 等的基因表達顯著增加。試驗結果表明，Quil A 上調了I型IFN 調節基因，I型和II型IFN以及炎癥細胞因子的表達水平，還可以增強細胞對PRRSV 的免疫防御。

4 小結與展望

皂苷作為佐劑具有低毒性、高活性等顯著優勢，同時也存在細胞毒性、肝腎毒性等缺點。皂苷佐劑不僅能延長疫苗的免疫周期，減少接種次數，也能調控免疫相關基因的表達，使干擾素調節因子、腫瘤壞死因子等的基因表達水平顯著上調，但具體通過什么路徑達到調控免疫的作用機制還需要更多的研究。目前，皂苷佐劑在獸用疫苗中已經得到較廣泛應用。隨著皂苷疫苗佐劑研究的不斷深入，越來越多的人用疫苗皂苷佐劑進入臨床研究。國外含有QS-21 皂苷的疫苗就有15 個正在進行臨床試驗。這些疫苗的指征包括非小細胞肺癌、黑素瘤和瘧疾等，其中4 種疫苗已進入III 期臨床試驗[38]。

我國植物資源豐富，擁有天然的藥用植物寶庫，現已經分離到較多的天然皂苷成分，但對于皂苷在疫苗中的應用研究，尤其是臨床研究明顯落后于美國等發達國家。今后的研究不能僅局限于天然皂苷資源的發掘和初步的藥理藥效學研究，更需要向高投入、高難度、高風險、高附加值的臨床應用研究轉變。一方面可以對天然皂苷的結構進行修飾，通過結構修飾達到減毒增效的目的；另一方面可以從制劑入手，開發新的劑型，或者新的給藥方式與途徑等，解決皂苷溶血性和細胞毒性等問題，使其在疫苗中的應用更加廣泛。