基因VI型新城疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

王靜靜，于曉慧，克軍宏，2，彭真奇，3，邢安琪，4，劉華雷

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.塔里木大學(xué)，新疆阿拉爾 843300；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥 230036；4.寧夏大學(xué)，寧夏銀川 750021）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）強(qiáng)毒株感染引起的一種禽的急性、高度接觸性傳染病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。NDV 具有遺傳多樣性，根據(jù)病毒F基因差異可分為I 和II 兩大類，I 類NDV 只有1 個(gè)基因型，均為弱毒株；II 類NDV 至少包括21 種基因型，其中既有弱毒株也有強(qiáng)毒株[1]。目前我國(guó)流行的強(qiáng)毒株主要為基因VI型和VII型，且病毒具有明顯的宿主特異性[2-3]。20 世紀(jì)80 年代后，基因VI型NDV 傳至世界各地，并一直在鴿群中流行和傳播[4-5]。國(guó)家新城疫參考實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)我國(guó)鴿群NDV 強(qiáng)毒陽(yáng)性率呈上升趨勢(shì)[6]，提示應(yīng)對(duì)鴿群中基因VI型NDV 強(qiáng)毒株加以關(guān)注。

目前，我國(guó)ND 診斷主要依靠RT-PCR 結(jié)合測(cè)序。NDV 強(qiáng)毒鑒定可通過(guò)測(cè)定1 日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）或病毒F 蛋白裂解位點(diǎn)序列分析進(jìn)行，通過(guò)病毒F 蛋白裂解位點(diǎn)堿性氨基酸數(shù)量判定病毒毒力。該方法檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需求。此外，多家實(shí)驗(yàn)室也建立了NDV強(qiáng)毒株熒光RT-PCR 檢測(cè)方法[7-9]，用于NDV 強(qiáng)毒株的快速篩查，但這些方法均無(wú)法區(qū)分病毒基因型，所以目前仍無(wú)專門針對(duì)基因VI型NDV 的快速檢測(cè)方法。為了滿足基因VI型NDV 的檢測(cè)需求，本研究針對(duì)NDVF基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了一種特異性強(qiáng)、敏感性高、快速有效的基因VI型NDV 檢測(cè)方法，為開展鴿群ND 的早期診斷提供了重要支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 I 類（基因1.1.2 亞型）、II 類（基因I型、II型、VI型、VII型）NDV、禽流感病毒（H5、H7、H9 亞型）、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽腺病毒、減蛋綜合征病毒、禽腦脊髓炎病毒等，均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測(cè)室保存。

1.1.2 臨床樣品 120 份鴿口咽/泄殖腔拭子，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測(cè)室保存。

1.1.3 試劑盒 High Pure Viral Nucleic Acid Kit核酸提取試劑盒，購(gòu)自Roche 公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 RT-PCR 試劑盒，購(gòu)自TaKaRa 公司；SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit 熒光RT-PCR 試劑盒，購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.4 cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品 基因VI型NDV cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測(cè)室制備和保存。

1.1.5 雞胚 9～11 日齡SPF 雞胚，購(gòu)自山東濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 引物、探針設(shè)計(jì)和篩選

從GenBank 上下載NDVF基因序列，采用MEGA 6 進(jìn)行序列比對(duì)分析，選取基因VI型NDV保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針（表1）。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 熒光RT-PCR 引物和探針

1.3 病毒核酸提取

按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書操作，提取病毒核酸，立即用于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 或RT-PCR 擴(kuò)增，或置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 反應(yīng)體系建立與優(yōu)化

以提取的基因VI型NDV RNA 為模板，按照實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光RT-PCR 擴(kuò)增，確定最佳引物和探針濃度以及退火溫度和時(shí)間。

引物探針濃度優(yōu)化：固定反應(yīng)體系引物終濃度為0.5 μmol/L，探針濃度分別為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 和0.50 μmol/L。根據(jù)檢測(cè)Ct 值確定最佳探針濃度。

退火溫度優(yōu)化：退火溫度分別設(shè)置為58、59和60 ℃，通過(guò)比較Ct 值確定最佳退火溫度。

退火時(shí)間優(yōu)化：退火時(shí)間分別設(shè)置為30、40、50、60 和70 s，通過(guò)檢測(cè)Ct 值確定最佳退火時(shí)間。

1.5 特異性試驗(yàn)

選擇具有代表性的12株基因VI型NDV，以及I 類（基因1.1.2 亞型）、II 類（基因I型、II型、VII型）NDV、禽流感病毒（H5、H7、H9 亞型）、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽腺病毒、減蛋綜合征病毒、禽腦脊髓炎病毒，提取核酸進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，評(píng)價(jià)方法的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn)

將基因VI型NDV cRNA 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍倍比稀釋，取濃度為5×109～5×100copies/μL 的樣品進(jìn)行熒光RT-PCR 擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)。

1.7 臨床樣品檢測(cè)

用建立的熒光RT-PCR 方法對(duì)臨床采集的120份鴿口咽/泄殖腔拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與病毒分離方法（病毒繁殖、RT-PCR 擴(kuò)增和序列分析）檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系建立和優(yōu)化

以基因VI型NDV RNA 為模板進(jìn)行熒光RT-PCR 擴(kuò)增，優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。確定的最終反應(yīng)體系：2×Reaction Mix 10.0 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，RTTaqMix 0.5 μL，模板RNA 2.0 μL，DEPC 水6.0 μL，總體積20.0 μL。反應(yīng)條件：50 ℃30 min，95 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共45 次循環(huán)。每次循環(huán)在60 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。

2.2 特異性試驗(yàn)

用國(guó)內(nèi)流行的5 種基因型NDV 和其他9 種常見禽病病毒核酸進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果（圖1）顯示：只有12株基因VI型NDV 核酸經(jīng)熒光RTPCR 擴(kuò)增后出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，基因1.1.2 亞型、基因I型、II型NDV 弱毒，基因VII型NDV 強(qiáng)毒，以及其他常見禽病病毒核酸經(jīng)熒光RT-PCR 擴(kuò)增后均無(wú)擴(kuò)增曲線。

2.3 敏感性試驗(yàn)

以濃度為5×109～5×100copies/μL 的cRNA樣品進(jìn)行熒光RT-PCR 擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)。結(jié)果（圖2）顯示，熒光RT-PCR 檢測(cè)下限為5 copies/μL。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

用建立的熒光RT-PCR 方法對(duì)臨床采集的120份鴿口咽/泄殖腔拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出陽(yáng)性樣品17 份，檢測(cè)結(jié)果與病毒分離方法完全一致，說(shuō)明本研究建立的熒光RT-PCR 方法可信度高，可用于臨床樣品中基因VI型NDV 檢測(cè)。

3 討論

ND 是影響我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。目前我國(guó)流行的NDV 強(qiáng)毒株分屬3 個(gè)基因型，即基因型VI型、VII型和XII型。其中，基因VII型和XII型NDV 分別在雞群和鵝群中流行，基因VI型NDV 在鴿群中流行。基因VI型NDV 曾被稱為鴿副黏病毒I型（pigeon paramyxovirus type 1，PPMV-1），是雞源NDV 跨種傳播至鴿后產(chǎn)生的變異株，也是導(dǎo)致全球第三次ND 大流行（20 世紀(jì)70 年代后期至80 年代）的主要流行毒株[10]。20 世紀(jì)80 年代我國(guó)首次分離到基因VI型NDV，隨后該基因型毒株一直在我國(guó)鴿群中流行。國(guó)家新城疫參考實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，近十年間鴿NDV強(qiáng)毒陽(yáng)性率明顯高于雞和水禽，且近兩年基因VI型NDV 流行強(qiáng)度明顯升高。基因VI型NDV 在我國(guó)分布廣泛[2，5，11]，沒(méi)有明顯的地域性，已經(jīng)成為我國(guó)當(dāng)前流行最為廣泛的強(qiáng)毒株，也是危害養(yǎng)鴿業(yè)健康發(fā)展的主要病原之一。因此，需要加強(qiáng)基因VI型NDV 的監(jiān)測(cè)預(yù)警，建立快速靈敏特異的檢測(cè)方法，為鴿ND 的早期診斷提供技術(shù)儲(chǔ)備。

目前，ND 弱毒活疫苗的普遍使用和弱毒株的大量存在[12-13]，給ND 確診帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。由于NDV 只有一個(gè)血清型，單純檢測(cè)NDV 的血清學(xué)方法（血凝抑制試驗(yàn)）和強(qiáng)弱毒通用的RT-PCR 技術(shù)已無(wú)法滿足快速確診和早期診斷的需求。ND 確診需要依靠病毒致病性評(píng)價(jià)。傳統(tǒng)的毒力測(cè)定方法為生物學(xué)試驗(yàn)，即ICPI 測(cè)定，此方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，且需要一定級(jí)別的生物安全實(shí)驗(yàn)室，不適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。目前，病毒毒力鑒定常用常規(guī)RT-PCR技術(shù)結(jié)合序列分析，但測(cè)序所需時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需求。近年來(lái)，反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）和熒光RT-PCR 等分子生物學(xué)技術(shù)也被用于NDV 檢測(cè)[8，14-15]，但現(xiàn)有方法主要是針對(duì)疫苗毒和基因VII型、IX型強(qiáng)毒株。本研究建立了一種基因VI型NDV 熒光RT-PCR 檢測(cè)方法，可在2.5～3 h 內(nèi)完成樣品檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、敏感性高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量臨床樣品檢測(cè)。