乳酸菌表層蛋白對其耐消化應激及腸道黏附能力的影響

陳大衛，程月，范佳明，申菲菲，任晨瑜，陳春萌，張瑞，張臣臣，關成冉，鄭英明，顧瑞霞

（1.揚州大學 江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室 食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.江蘇宇航食品科技有限公司，江蘇 東臺224000；3.揚州市中醫院，江蘇 揚州 225000）

0 引言

乳酸菌作為機體腸道中的重要益生菌，具有改善腸道微生態平衡、增強機體免疫等重要的生理功能[1-2]。而乳酸菌在經過機體消化道時，只有耐受住唾液、胃液（pH 3.0）、腸液（0.1%～0.3%膽鹽）和胰液（0.1%胰酶）等不良環境的應激，以較高的存活率到達并定植在腸道內，才能更好的發揮其益生作用[3-5]。乳酸菌在腸上皮細胞上的黏附有助于加強其與腸上皮細胞間的信息交流，進而通過調節腸道菌群、代謝產物以及排斥、競爭和替代等方式來抑制腸道病原菌的黏附等來改善機體免疫低下、過氧化、腹瀉等不良癥狀[6]。因此，耐消化應激并能夠較好的黏附于腸道是益生乳酸菌篩選的重要指標之一。

表層蛋白是存在于乳酸菌菌株細胞壁外層的一種蛋白，由單分子蛋白質亞單位組成，在不良環境中能夠較好的保護菌體，提高其存活率，特別是在人體消化過程中面臨的低pH 和高濃度膽鹽等各種各樣的應激[7-8]；同時，表層蛋白也是乳酸菌重要的黏附素之一，能夠提高菌株在腸道的停留時間，有助于其更好的黏附在腸道上。越來越多的研究也發現，表層蛋白在乳酸菌抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等腸道病原菌黏附于腸道的過程中發揮著重要作用[9-11]；此外，表層蛋白還可以與免疫系統中的特異性抗原DC-SIGN 相結合，通過調控細胞因子的分泌來調節機體的免疫反應[12]。然而，目前關于耐消化應激的乳酸菌在依次經過模擬唾液-胃液-腸液應激后其表層蛋白的保護作用研究較少；對菌株抑制大腸桿菌黏附腸道的方式的影響尚不清楚。因此，本文研究了實驗室保藏的來源于廣西巴馬長壽人群腸道和傳統發酵食品的12 株乳酸菌在模擬唾液-腸液-胃液中的應激能力及其表層蛋白的攜帶情況，然后探討了消化應激能力較強的乳酸菌表層蛋白對其消化應激、腸上皮Caco-2 細胞的黏附以及抑制大腸桿菌黏附腸道的影響；為益生乳酸菌的篩選及其益生作用的機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）W198、S7，嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）W191、W165、W193、W173、W172、W169， 副干酪乳桿菌（Lactobacillusparacasei）m111，發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）148，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）108、W116，揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室；大腸桿菌（Escherichia coli）CICC10899，中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑

溶菌酶、胃蛋白酶（1∶10000）、胰蛋白酶（1∶250），生工生物工程（上海）股份有限公司；MRS（De Man Rogosa Sharpe）培養基、LB（Luria-Bertani）培養基，青島海博生物技術有限公司；牛膽鹽，北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司；MEM（Minimum Essential Medium）培養液、丙酮酸鈉溶液、氨基酸溶液、谷氨酰胺添加劑，美國Gibco 公司；血清，美國Clark Bioscience 公司；磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS，pH 7.2）、0.25%胰酶細胞消化液，上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 儀器與設備

全自動滅菌鍋JF-SX-500，日本TOMY 公司；恒溫培養箱DNP-9272，上海精宏實驗設備有限公司；高速冷凍離心機Legend mach1.6 R，美國塞默飛世爾科技有限公司；超凈工作臺SW-CJ-1F，蘇州凈化設各有限公司；細胞計數儀IC1000，美國Count star 公司；熒光倒置顯微鏡IX2-ILL100，日本OLYMPUS 公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）電泳儀HX-2000，美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 模擬唾液、胃液、腸液及培養基的制備

模擬唾液：用去離子水配置含0.75 mmol/L CaCl2、3.70 mmol/L KH2PO4、0.15 mmol/L MgCl2(H2O)6、15.10 mmol/L KCl、0.06 mmol/L(NH4)2CO3、13.60 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl 的儲備液，取一定量的儲備液加入溶菌酶至終濃度為100 mg/L，調節pH 至7.0，0.22 μm 濾膜除菌，現配現用。

模擬胃液：用去離子水配置含0.075 mmol/L CaCl2、0.90 mmol/L KH2PO4、0.10 mmol/L MgCl2(H2O)6、6.90 mmol/L KCl、0.50 mmol/L (NH4)2CO3、25 mmol/L NaHCO3、47.20 mmol/L NaCl 的儲備液，取一定量的儲備液加入胃蛋白酶至終濃度為3.00 g/L，調節pH 至3.0，0.22 μm 濾膜除菌，現配現用。

模擬腸液：用去離子水配置含0.30 mmol/L CaCl2、0.80 mmol/L KH2PO4、0.33 mmol/L MgCl2(H2O)6、6.90 mmol/L KCl、0.50 mmol/L (NH4)2CO3、85 mmol/L NaHCO3、38.40 mmol/L NaCl 的儲備液，取一定量的儲備液加入胰蛋白酶和膽鹽至終濃度分別位0.1%和0.3%，調節pH 至8.0，0.22 μm 濾膜除菌，現配現用。

MEM 完全消化培養液：77% MEM 培養液、20%Clark 胎牛血清、1%MEM 非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸鈉溶液、1%GlutaMAX 谷氨酰胺添加劑，4 ℃貯藏備用。

1.2.2 乳酸菌的消化應激能力

將活化后的乳酸菌按3%的接種量接種于MRS 液體培養基中，37 ℃培養至對數期，收集菌株后重懸于模擬唾液中，37 ℃孵育5 min 后，8000g，4 ℃離心10 min；然后將菌體沉淀重懸于模擬胃液中，37 ℃孵育3 h 后，8000g，4 ℃離心10 min；再將菌體沉淀重懸于模擬腸液中，37 ℃孵育2 h。每一次應激后均選取合適的稀釋梯度，利用平板菌落計數法計算乳酸菌的活菌數[13]。

1.2.3 乳酸菌表層蛋白的提取

將活化后的乳酸菌按3%的接種量接種于MRS 液體培養基中，37 ℃條件下培養至對數期，加入1/20 MRS 培養基體積的5 mol/L 的LiCl 溶液，于37 ℃振蕩（200 rpm/min）培養30 min，4 ℃、8000g離心10 min 收集上清液，得到表層蛋白粗提液[14]。將粗提液過0.22 μm 的無菌親水性微孔濾膜后，再裝入2000 u 透析袋中于4 ℃透析，期間多次更換透析液，48 h 后離心懸濁液并收集沉淀，冷凍干燥后得到表層蛋白粗提物，采用5%的濃縮膠與12%的分離膠進行SDS-PAGE 電泳試驗，保藏于-20 ℃冰箱中備用[15]。

1.2.4 表層蛋白對乳酸菌消化應激能力的影響

LiCl 處理前后的乳酸菌用無菌PBS 洗滌2 次，收集菌體沉淀，按1.3.2 章節測定乳酸菌的消化應激能力。

1.2.5 表層蛋白對乳酸菌黏附Caco-2 細胞能力的影響

將培養好的Caco-2 細胞以2×105cells/mL 接種于24 孔細胞培養板中，37 ℃，5% CO2培養至單層，用無菌PBS 洗滌2 次后，分別接種LiCl 處理前后的0.5 mL 108CFU/mL 乳酸菌菌懸液于細胞培養板中培養2 h，PBS 洗滌3 次去除未黏附的乳酸菌；每孔中加入0.15 mL 0.25%胰蛋白酶消化至細胞完全脫落后，加入0.35 mL MEM 完全培養液終止消化，采用平板菌落計數法檢測乳酸菌活菌數，并根據公式（1）分別計算LiCl 處理前后乳酸菌的黏附率。

1.2.6 表層蛋白對乳酸菌抑制病原菌黏附能力的影響

按3%的接種量接種大腸桿菌于LB 液體培養基中，37 ℃恒溫搖床培養12 h，離心菌體后用無菌PBS調整菌懸液濃度至1×108CFU/mL 備用；離心收集消化應激前后的乳酸菌菌體，用無菌PBS 調整菌懸液濃度至1×108CFU/mL 備用；將細胞培養板中培養至單層的Caco-2 細胞用無菌PBS 洗滌2 次，分別進行排斥、取代及競爭試驗。

1.2.6.1 排斥黏附實驗

分別接種0.5 mL LiCl 處理前后的乳酸菌菌懸液和0.5 mL PBS 至細胞培養板中，37 ℃，5%CO2培養1 h；PBS 洗滌2 次，除去未黏附的乳酸菌；分別加入0.5 mL 1×108CFU/mL 大腸桿菌菌懸液和0.5 mL PBS，37 ℃，5%CO2培養1 h，PBS 洗滌3 次，除去未黏附的細菌后加入0.15 mL 胰酶消化液，待細胞完全脫落后加入0.35 mL MEM 完全培養液終止消化，收集菌懸液，采用傾注平板計數法于LB 培養基中檢測大腸桿菌的活菌數，并根據公式（2）計算乳酸菌對大腸桿菌的黏附抑制率。

式中：A0為未接種乳酸菌時，黏附在Caco-2 細胞上的大腸桿菌活菌數；A1為接種乳酸菌后，黏附在Caco-2 細胞上的乳酸菌活菌數。

1.2.6.2 競爭黏附實驗

分別接種0.5 mL LiCl 處理前后的1×108CFU/mL乳酸菌菌懸液和0.5 mL1×108CFU/mL 大腸桿菌菌懸液至細胞培養板中，37 ℃，5% CO2培養2 h，PBS 洗滌3 次后，除去未黏附的細菌。加入0.15 mL 胰酶消化液，待細胞完全脫落后加入0.35 mL MEM 完全培養液終止消化，收集菌懸液，采用傾注平板計數法于LB 培養基中檢測大腸桿菌的活菌數，根據公式（2）計算乳酸菌對大腸桿菌的黏附抑制率。

1.2.6.3 替代黏附實驗

接種0.5 mL1×108CFU/mL 大腸桿菌菌懸液和0.5 mL PBS 至細胞培養板中，37 ℃，5% CO2培養1 h后，PBS 洗滌2 次除去未黏附的大腸桿菌；接種0.5 mL LiCl 處理前后的108CFU/mL 乳酸菌菌懸液和0.5 mL PBS，37 ℃，5% CO2培養1 h，用無菌PBS 洗滌3 次除去未黏附的細菌；加入0.15 mL 胰酶消化液，待細胞完全脫落后加入0.35 mL MEM 完全培養液終止消化，收集菌懸液，采用傾注平板計數法于LB 培養基中檢測大腸桿菌的活菌數，根據公式（2）計算乳酸菌對大腸桿菌的黏附抑制率。

1.3 數據處理與分析

利用SPSS 20.0 軟件及SigmaPlot 10.0 等軟件對試驗的數據進行統計和分析，數據采用均值±標準差（Mean±SD）表示，以單因素方差分析進行顯著性檢驗，p<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的消化應激能力

將12 株乳酸菌菌體依次重懸于模擬唾液、胃液及腸液中，研究其耐消化應激能力，結果如表1 所示。

表1 乳酸菌的耐消化應激能力

由表1 可知，在經過唾液應激之后，菌株148、S7及W172 的活菌數顯著低于未應激的初始活菌數（p<0.05），而菌株108、W116、W165、W169、W191、W193 及W198 等則顯著高于未應激的初始活菌數（p<0.05）；經過模擬唾液-胃液應激后，菌株m111、W116 及W198 的活菌數顯著高于未應激的（p<0.05），菌株m111 和W116 的活菌數較唾液應激后顯著上升（p<0.05），W198 則無顯著性變化（p>0.05），而菌株148、S7、W165、W169、W172、W173、W191 及W193 的活菌數顯著降低（p<0.05）；經過模擬唾液-胃液-腸液應激后，試驗的12 株乳酸菌活菌數均顯著降低（p<0.05），但菌株W198、S7 及m111 的存活率均大于3.53%，顯著高于其他菌株（p<0.05）。

2.2 乳酸菌的表層蛋白

利用SDS-PAGE 研究菌株S7、W198 及m111 攜帶表層蛋白的情況，結果如圖1 所示。

圖1 乳酸菌表層LiCl 提取物的SDS-PAGE 圖譜

由圖1 可知，菌株S7、W198 和m111 的LiCl 提取物在25～71 ku 之間均有明顯的蛋白條帶，表明3 株乳酸菌均攜帶表層蛋白。

2.3 表層蛋白對乳酸菌耐受消化應激能力的影響

表層蛋白是菌體的生理屏障，能夠維持細胞結構完整性；因此，研究了LiCl 去除乳酸菌表層蛋白前后，其對消化道的應激情況，結果見圖2。

圖2 表層蛋白對乳酸菌耐消化應激的影響

由圖2 可知，LiCl 未處理前，菌株W198 在經過模擬唾液-胃液-腸液的應激后的存活率顯著高于其余兩株乳酸菌（p<0.05）；而LiCl 處理后，菌株S7、W198和m111 的存活率均顯著下降（p<0.05），存活率分別下降了12.08%、38.32%和2.35%；且菌株W198 的存活率依舊顯著高于其余兩株乳酸菌（p<0.05）；表明表層蛋白在3 株乳酸菌的耐消化應激過程中對菌體具有重要的保護作用。

2.4 表層蛋白對乳酸菌黏附Caco-2 細胞能力的影響

利用LiCl 處理乳酸菌表層蛋白，研究表層蛋白對乳酸菌黏附人腸上皮Caco-2 細胞的影響，結果如圖3 所示。

圖3 表層蛋白對乳酸菌黏附Caco-2 細胞的影響

由圖3 可知，菌株m111 對Caco-2 細胞的黏附能力顯著高于其余兩株菌（p<0.05）；而去除表層蛋白后，菌株S7、W198 和m111 黏附率均顯著下降（p<0.05），分別下降了6.64%、5.10%和14.43%，但菌株間的黏附能力無顯著性差異（p<0.05）；表明表層蛋白是3 株乳酸菌黏附Caco-2 細胞的主要黏附素。

2.5 表層蛋白對乳酸菌抑制病原菌黏附能力的影響

分別將3 株LiCl 處理前后的乳酸菌與大腸桿菌進行排斥、競爭和取代試驗，研究表層蛋白對乳酸菌抑制大腸桿菌黏附能力的影響，結果見圖4。

由圖4 可知，3 株乳酸菌均可以通過抑制、競爭和取代的方式來抑制大腸桿菌對Caco-2 細胞的黏附。未經LiCl 處理的菌株S7 和W198 通過替代的方式來抑制大腸桿菌黏附Caco-2 細胞的能力顯著高于其他方式（p<0.05），抑制率分別達到86.61%和71.01%；而未經LiCl 處理的菌株m111 通過競爭和替代的方式來抑制大腸桿菌黏附Caco-2 細胞的能力顯著高于排斥的方式（p<0.05）。

圖4 表層蛋白對乳酸菌抑制大腸桿菌黏附Caco-2 細胞的影響

經LiCl 處理即去除表層蛋白后，菌株S7 通過排斥、競爭和替代的方式來抑制大腸桿菌的黏附能力分別顯著下降了4.22%、18.70%和12.06%（p<0.05）；菌株W198 和m111 通過排斥和替代的方式來抑制大腸桿菌黏附的能力均顯著下降（p<0.05），其中菌株W198 分別下降了41.56%和22.20%，菌株m111 分別下降了21.25%和30.40%；而菌株W198 和m111 通過競爭的方式來抑制大腸桿菌黏附的能力沒有發生顯著性變化（p>0.05）。

3 討 論

由于乳酸菌肽聚糖層中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1, 4 糖苷鍵很容易被溶菌酶水解[16]，因此在經過模擬唾液應激后，發酵乳桿菌148、植物乳桿菌S7 及嗜熱鏈球菌W172 的活菌數顯著低于初始活菌數（p<0.05）；而有些菌株的活菌數反而顯著升高（p<0.05），可能是由于口腔應激上調了菌株hsp1 基因的表達[17]，而hsp1 基因在菌株適應不良環境的應激過程中發揮著重要作用[18]。到目前為止，還未發現嗜熱鏈球菌攜帶表層蛋白，而乳桿菌中則含有1 種甚至2-3 種表層蛋白，其在菌株面對胃液中胃蛋白酶、低pH 等不良環境的應激時具有較好的保護作用[19]；因此，在經過模擬唾液-胃液應激后，實驗的嗜熱鏈球菌活菌數下降顯著（p<0.05），而乳桿菌活菌數下降幅度相對較低。

在依次經過模擬唾液-胃液-腸液應激后，菌株S7、植物乳桿菌W198 和副干酪乳桿菌m111 仍具有較高的存活率，可能是由于菌株的表層蛋白及不良環境刺激菌體分泌的膽鹽水解酶、胞外多糖等防御機制來保護菌體免受傷害[20]；而在去除表層蛋白后，菌株的存活率及對Caco-2 細胞的黏附率均顯著下降（p<0.05），表明表層蛋白是3 株乳桿菌在面對消化道不良環境應激時的主要防御屏障，也是菌株黏附腸道的主要黏附素。實驗結果還發現，菌株S7、W198 和m111 均可以通過排斥、競爭和替代的方式來抑制大腸桿菌對腸細胞的黏附，表明3 株乳桿菌抑制大腸桿菌黏附腸道可能與空間位阻的作用密切相關，而這種作用可能與菌株本身對Caco-2 細胞具有高度親和力有關[21]，菌株通過占據大腸桿菌與Caco-2 細胞的結合位點來發揮其屏障作用，進而改善大腸桿菌定殖引發的腸道菌群紊亂，維護腸道微生態的平衡與功能完整性[22-23]。

去除表層蛋白后，菌株S7、W198 及m111 抑制大腸桿菌黏附腸細胞的能力顯著下降（p<0.05），表明表層蛋白在菌株抑制大腸桿菌黏附腸細胞的過程中發揮重要作用；而表層蛋白的去除容易導致菌株與大腸桿菌競爭腸細胞表面黏附位點的能力減弱[21]，也降低了菌株表面物質水解大腸桿菌細胞壁肽聚糖的能力[24]。去除表層蛋白前后，3 株乳桿菌抑制大腸桿菌黏附的主要方式沒有發生變化，菌株S7 和W198 的主要抑制方式是替代，而m111 為競爭；表明即使在大腸桿菌事先占據黏附位點的情況下，菌株S7 和W198 到達腸道后仍具有較強的替代大腸桿菌黏附腸細胞的能力；而當菌株m111 和大腸桿菌同時進入腸道時，菌株m111 表面的黏附分子也具有較強的競爭腸細胞表面黏附位點的能力；而這種抑制大腸桿菌黏附腸道的主要方式的差異可能與菌株表層蛋白的種類有關[25]。

4 結論

植物乳桿S7、W198 和副干酪乳桿菌m111 在依次經過模擬唾液-胃液-腸液后，具有較強的耐消化應激的能力；其表層蛋白在3 株乳酸菌耐消化應激和黏附腸上皮細胞的過程中發揮重要作用，且可以通過排斥、競爭和替代的方式來抑制大腸桿菌黏附于腸上皮細胞。本文的研究為高耐受消化應激和高腸道黏附的益生乳酸菌的篩選提供參考依據。