鼠李糖乳桿菌grx10 在常溫褐色乳酸菌飲料中的應用

魏楓染，劉媛，賈志磊，劉絨梅，胡詩齊，李啟明

（新希望乳業股份有限公司科技研究院 乳品營養與功能四川省重點實驗室，成都 610000）

0 引言

常溫褐色乳酸菌飲料發酵劑目前多選用干酪（副干酪）乳桿菌，如副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei Lpc37。穩定性好[1]，但發酵時間久，且依賴進口，有技術風險，成本高昂[2]。若我國本土來源菌株能將其替換，既可節約成本也可證實我國相關企業具備自有菌株篩選和工業化應用能力。

鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus grx10，是我國自主分離篩選的益生型專利乳酸菌（專利號：ZL200810023014.X），源自新疆傳統酸駱駝奶[3-5]。有研究表明，該菌株有較為顯著地降低膽固醇及抑菌能力，并可應用于食品領域，發酵產酸能力較強[6]。

本研究旨在將grx10 應用于常溫褐飲，完成實驗室小試及生產線中試，綜合評價菌種對褐變引起的質構及風味變化的適應能力和保質期內的穩定性[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂乳粉（蛋白質≥3.2g/100mL，脂肪≤0.9g/100mL），NZMP 公司；食用葡萄糖，西王藥業公司；白砂糖，雙江南華糖業公司；果膠，安德利集團公司；檸檬酸，珍好食品配料公司；鼠李糖乳桿菌grx10，一然生物科技公司；副干酪乳桿菌Lpc37，杜邦公司。

RO 水，自制；分析純氫氧化鈉，環凱微生物科技公司。

1.2 設備

ICINAC 16 乳品酸化監控儀，AMS-Alliance 公司；LumiSizer611 穩定性分析儀，LUM 公司；RW 20 數顯型頂置式攪拌器，IKA 公司；TA.XTplus 物性測試儀，超技儀器公司；MS603 電子天平，METTLER TOLEDO 公司；APV-1000 均質機，沃迪智能裝備公司；BSC-250 恒溫恒濕箱，博訊實業公司；SW-CJ-2FD 潔凈工作臺，安泰空氣技術公司；T5+Rondolino 電位滴定儀，METTLER TOLEDO 公司；FE20 pH 計，METTLER TOLEDO 公司；DV-E 數顯黏度計，BROOKFIELD 公司。

2 方 法

2.1 配方工藝

（1）飲料基礎配方。

褐色酸奶發酵液（脫脂乳粉10%、葡萄糖4%、發酵劑）25%、果膠0.4%、白砂糖8%、檸檬酸0.1%、RO 水約66.5%

（2）酸奶發酵工藝。

稱取脫脂乳粉和葡萄糖→50～55 ℃攪拌化料→保溫水合30 min→定容→20 MPa 均質—保溫褐變3 h→冷卻至接種溫度→接種發酵→終點酸度停止發酵→破乳攪拌→冷卻備用

（3）飲料調配工藝。

稱取白砂糖、 果膠等物料→70～75 ℃剪切化料→冷卻至小于15 ℃→與酸奶混合→粗定容—檢測并噴酸→定容→20 MPa均質→滅菌→冷卻→灌裝

2.2 grx10 發酵條件篩選

實驗室研究grx10 在37 ℃及42 ℃（工業常用發酵溫度）條件下不同接種量的發酵效果，接種量設定為A：1×107mL-1，B：2×107mL-1，C：3×107mL-1，D：4×107mL-1，E：5×107mL-1。通過發酵監測并結合生產實際探索grx10 在發酵褐色酸奶時（終點pH：3.60～3.70；終點酸度：150～180 °T），不同發酵溫度下的最適接種量。

2.3 菌種質構對比

選取2.2 得到的最佳接種量，在37 ℃及42 ℃條件下發酵褐色酸奶，通過質構測定驗證grx10 的適用性。

2.4 飲料感官品評

在2.3 的基礎上進行常溫褐色乳酸菌飲料小試，通過感官品評判斷菌種最佳發酵溫度，進一步評判grx10 的適用性。

2.5 貨架期穩定性研究

在上述研究的基礎上進行中試，保證只有菌種差異，其他配方及工藝完全相同。對樣品進行穩定性分析，測定各項指標在離心加速條件下的具體變化，并進行貨架期觀測。穩定性評定細則如表1 所示。貨架期觀測會將飲料成品在常溫（25～30 ℃）條件下貯存12 個月，觀察沉淀、析水、顏色變化、脂肪上浮、風味變化情況等，并測定pH、酸度和固形物等指標，從而綜合評判grx10 的穩定性。

表1 常溫褐色乳酸菌飲料穩定性評定細則

2.6 項目評定及方法

2.6.1 發酵監測

利用發酵監測儀進行監測，以樣品溫度作為發酵監測起點，以pH 范圍作為發酵監測終點，監測過程中每隔1 min 記錄一次數據，數據處理時每1 h 計算pH平均值。

2.6.2 質構測定

利用物性測試儀測定硬度、稠度、內聚力、黏性等指標。參數設定如表2 所示。

表2 物性測試儀參數設定

2.6.3 感官品評

邀請15 名專業感官品評員進行描述分析型測試，以實際分數評判各項品評維度，以期準確顯示在所評價的感官特性范圍內不同處理組的各項特征，通過數據的處理分析得出相關結論。評定標準如表3 所示。

表3 常溫褐色乳酸菌飲料感官評定標準

2.6.4 穩定性分析

利用Lumi 穩定性加速分析儀，量化產品在離心加速條件下各項穩定性指標的變化情況。參數設定如表4 所示。

表4 Lumi 參數設定

2.6.5 貨架期穩定性觀測

將產品置于樣品架上，在常溫（25～30 ℃）下放置12 個月，觀察期內記錄穩定性異常現象并量化其程度，觀測指標如表5 所示。

表5 貨架期觀測指標

pH 值測定：利用pH 計在室溫下測定并讀數。

固形物測定：利用折光儀測定固形物指標。

酸度測定：利用酸度計測定酸度指標。

黏度測定：利用數顯黏度計在室溫下測定并讀數（61#轉子；20 r/min，30 s）。

密度測定：利用密度計測定密度指標。

顯著性分析：利用IBM SPSS Statistics 24 應用軟件進行分析。

3 結果與分析

3.1 grx10 發酵條件篩選結果

37 ℃下不同接種量發酵監測結果如圖1 所示；42 ℃下不同接種量發酵監測結果如圖2 所示。

圖1 37 ℃條件下grx10 發酵監測

圖2 42 ℃條件下grx10 發酵監測

由圖1 可知，grx10 在37 ℃和42 ℃條件下，接種量1×107，2×107，3×107間差異顯著（P＜0.05），3×107，4×107，5×107間差異不顯著（P＞0.05）。37 ℃下不同接種量（從低到高）達到發酵終點（以pH 值3.65 計）的時間分別為：＞75＞75、61、58、57。42 ℃下分別為：＞52、45、35、34、33 h。

綜上，37 ℃下，grx10 接種量為1×107，2×107時達到發酵終點所需的發酵時間均超過3 d，實際生產方面酸奶基料發酵過久占用發酵罐會造成較大損耗，使產品成本上漲，當接種量為3×107時61 h 即可達到發酵終點。而當接種量繼續上漲時，其發酵速率并不會明顯加快，接種量為4×107，5×107mL-1時較3×107mL-1達到發酵終點所需的時間相差＜5 h，能耗節約較少，但卻要增加物料成本。綜上，37 ℃下，grx10 的最適接種量為3×107。42 ℃下，發酵時間較37 ℃有明顯縮短，grx10 接種量為1×107，2×107mL-1時達到發酵終點所需的發酵時間超過或接近2 d，接種量為3×107mL-1時35 h 可達發酵終點。當接種量繼續增加時，其發酵速率亦不會明顯加快，接種量為4×107，5×107mL-1時較3×107mL-1達到發酵終點所需的時間差別＜3 h。綜上，42 ℃下，grx10 的最適接種量也為3×107mL-1。

3.2 grx10 與Lpc37 發酵褐色酸奶質構對比結果

37 ℃及42 ℃條件下鼠李糖乳桿菌grx10 與副干酪乳桿菌Lpc37 對比結果如圖3 所示。圖3 中字母a，b 表示差異顯著性及多重比較結果。

由圖3 可知，鼠李糖乳桿菌grx10 與副干酪乳桿菌Lpc37 在37 ℃和42 ℃下，達到發酵終點的酸奶質構，在硬度、稠度、內聚力、黏性方面差異均不顯著（P＞0.05）。

圖3 37 ℃及42 ℃下grx10 與Lpc37 發酵褐色酸奶質構對比

綜上，不論發酵溫度是37 ℃還是42 ℃，同一溫度下，grx10 與Lpc37 作為發酵劑，制成的褐色酸奶在質構上差異均不顯著（P＞0.05）。Lpc37 是常溫褐色乳酸菌飲料中廣泛應用的發酵劑，且市場售賣的產品保質期基本標示8～9 個月。所以作為對照組的grx10，二者在相同發酵溫度及接種量條件下發酵的褐色酸奶，質構維度測定值相近可說明grx10 與Lpc37 作為發酵劑，對褐色酸奶質構的影響不相上下，且有研究證實鼠李糖乳桿菌對人腸道微生物菌群有益生作用[9]，所以grx10 可正常作為發酵劑使用，并達到Lpc37 發酵的質構狀態。

3.3 飲料感官品評對比結果

飲料感官品評對比結果如表6 所示。

由表6 可以看出，發酵溫度相同時，不同發酵劑制成的飲料，其各項感官維度評分間差異不顯著（P＞0.05）；發酵溫度不同時，相同發酵劑制成的飲料，其整體評價、風味釋放、稠厚3 項感官維度評分差異顯著（P＜0.05），色澤、酸甜2 項感官維度評分差異不顯著（P＞0.05）。無論grx10 還是Lpc37 做發酵劑，37 ℃下的整體評價和風味釋放平均分均高于42 ℃條件。

表6 飲料感官品評對比結果

綜上，感官評價層面，37 ℃優于42 ℃，且由于鼠李糖乳桿菌可能出現熱應激反應，故應盡量避免高溫長時發酵[10]。所以，制備常溫褐色乳酸菌飲料時，最佳發酵條件為37 ℃。該條件下，grx10 與Lpc37 制成的飲料感官評價差異小，進一步印證了grx10 可作為發酵劑用于常溫褐色乳酸菌飲料，并達到Lpc37 作發酵劑的效果。

3.4 穩定性研究結果

在上述研究的基礎上，保證只有菌種差異的前提下進行中試，將產品進行穩定性加速分析及貨架期觀測，結果如下。

（1）穩定性加速分析結果如圖4 和圖5 所示。由圖4可以看出，37 ℃下，grx10 與Lpc37 制成的飲料在穩定性加速分析結束時，澄清指數的區間變化趨勢及區間均值差異不顯著（P＞0.05）。由圖5 可以看出，37 ℃下，grx10 與Lpc37 制成的飲料在離心加速分析結束時，二者均出現底部沉淀現象，且沉淀量隨時間均勻增加。其中鼠李糖褐飲沉淀層約為2 mm，副干酪褐飲沉淀層約為2.5 mm。

圖4 褐飲中試樣Lumi 澄清指數變化趨勢對比

圖5 褐飲中試樣Lumi 分析

(2)貨架期內穩定性觀測結果如表7 所示。由表7 可以看出，12 個月貨架觀測期內，上部析水、顏色變化、絮凝及分層情況，grx10 與Lpc37 變化一致。底部沉淀情況，grx10 產品出現時間略早于Lpc37 產品，但二者沉淀量后期維持一致。10 月開始沉淀量超過2mm，顏色出現較嚴重變化，且出現絮凝及分層現象。所以產品維持穩定的期限為9 個月。

表7 貨架期內穩定性觀測結果

(3) 貨架期內理化監測結果如表8 所示。由表8 可以看出，12 月觀測期內，grx10 與Lpc37 在pH 值、固形物、酸度、黏度、密度方面的監測值接近，且變化趨勢差異均不顯著（P＞0.05）。pH 方面，第1～9 月略有浮動，總體維持在3.50～3.60 的正常范圍，從第10 月開始，變化量增加；固形物方面，第1～9 月略有浮動，總變化量≤0.5，從第10 月開始，變化量較前9 月明顯增加；酸度方面，第1～9 月略有浮動，月均變化量＜0.5，但從第10 月開始，變化量較前9 月明顯增加，月均變化量＞2.0；黏度方面，第1～9 月略有浮動，總變化量≤3.0，屬正常變化范圍，但從第10 月開始黏度明顯降低且變化量逐月遞增；密度方面，第1～9 月維持不變，但從第10 月開始密度降低。

表8 貨架期內理化監測結果

(4)貨架期內感官評價結果根據上述觀測結果，在9個月內每隔3 個月取樣品評，結果如表9 所示。由表9可以看出，grx10 與Lpc37 在整體評價、色澤、風味釋放、稠厚、酸甜等感官維度，同期對比差異均不顯著（P＞0.05）。觀測期內，二者整體評價及風味釋放評分均在4.5分以上（含4.5 分），稠厚及酸甜也均在適中范圍。

表9 貨架期內飲料感官評價對比結果

綜上，用grx10 和Lpc37 作發酵劑制成的中試樣品，在穩定性加速分析結束時，其澄清指數的變化趨勢及區間均值差異不顯著（P＞0.05）；從變化曲線來看，grx10 與Lpc37 整體變化趨勢相似，差異不顯著（P＞0.05）。樣品管上部透射率在分析結束時，grx10 約有0.5 mm 透射率降至59%～60%，Lpc37 約有0.5 mm 透射率降至55%～56%；中部透射率均從初始的10%～20%提升至80%～90%；底部透射率在分析結束時，grx10 約有2.0 mm 透射率降至0%～10%，Lpc37 約有2.5 mm 透射率降至0%～10%。說明產品貨架期內可能會出現沉淀，且grx10 沉淀量較Lpc37 少，加速分析結果更優。貨架期觀測12 個月，第1～9 月grx10 與Lpc37 對比來看，在各項觀測指標下的變化差異不顯著（P＞0.05），維持穩定。但9個月以后，各項觀測維度都開始有明顯異變，無法維持穩定。但副干酪乳桿菌是應用性能良好的發酵劑，其在食品生產領域非常成熟[11-12]。所以，grx10 與Lpc37 兩種發酵劑制成的飲料保質期均可達9 個月。保質期內，二者穩定性變化差異不顯著（P＞0.05），感官評價差異不顯著（P＞0.05）。說明grx10 的貨架期穩定性與應用性能良好且廣泛使用的Lpc37 相近。

4 結論

grx10 在37 ℃和42 ℃條件下發酵褐色酸奶的最適接種量均為3×107mL-1。37 ℃條件下，61 h 可達發酵終點；42 ℃條件下，35 h 可達發酵終點。

37 ℃和42 ℃條件下，grx10 與Lpc37 作為發酵劑，制成的褐色酸奶在硬度、稠度、內聚力、黏性等食品質構維度上差異不顯著（P＞0.05）。

不同發酵溫度對褐色酸奶風味有影響，37 ℃條件優于42 ℃條件。相同溫度下，grx10 與Lpc37 作為發酵劑，制成的褐色酸奶感官評價差異不顯著（P＞0.05）。

grx10 與Lpc37 作為發酵劑，制備的常溫褐色乳酸菌飲料中試產品，貨架期內穩定性變化差異不顯著（P＞0.05），保質期均能在常溫條件下達到9 個月。

綜上，鼠李糖乳桿菌grx10 可用于常溫褐色乳酸菌飲料的制備及生產。成品的風味、質構、穩定性等，均與目前工業化應用成熟的副干酪乳桿菌Lpc37 相似，說明我國本土來源的專利菌種具備優良的商業化應用能力，新的本土商業化菌種篩選及應用前景廣闊。