母乳中膽鹽激活脂肪酶性質及功能的研究進展

楊寶嘉，蘆晶，呂加平，逄曉陽，張書文，劉妍妍

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163000；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；3.北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

0 引言

膽鹽激活脂肪酶 (Bile salt stimulated lipase，BSSL)也被稱為羧酸酯脂肪酶和膽固醇酯酶是一種對各種脂類具有活性的酯酶，包括甘油酯、膽固醇和脂溶性維生素。早期，認為腸腔內的BSSL 起源于乳腺或胰腺[1]。進一步研究發現在血小板、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和肝臟、內皮細胞等也有表達[2]。BSSL 也是一些哺乳動物母乳的重要組成部分，如人類、小鼠等，但不包括大鼠和牛。眾所周知，新生兒的健康快速的成長需要飲用優質的脂肪和必需營養素。然而，嬰兒外分泌胰腺在出生時是不成熟的，分泌BSSL 的含量不足以支持脂肪的充分吸收[3]。但這種脂肪吸收不良現象幾乎只出現在配方奶喂養的嬰兒中，母乳喂養則不會出現該情況。1977年，Olle 首次報道BSSL 在人乳中大量存在，約占人乳蛋白總量的1%[4]。

1 BSSL 的結構及性質

理化性質：BSSL 發揮作用的最適pH 值為7.3～8.6，但在酸性環境下也仍能發揮作用，在pH3.5，37 ℃的環境1 h 也仍能保持活性不被破壞[1]。因此，這也可以說明在其經過胃部的酸性環境條件，到達十二指腸時BSSL 活性可以保持穩定而不被破壞。但BSSL 對高溫敏感性極強，如巴氏殺菌（62.5 ℃，30 min）會使BSSL完全喪失失活，但低溫冷藏、凍融對BSSL 的活性幾乎無影響。人奶中的乳鐵蛋白可以使BSSL 活性提升近1.4 倍；毒扁豆堿和二異丙基氟磷酸對BSSL 活性具有抑制作用[5]。

基因結構特點：BSSL 基因位于9 號染色體長臂端粒部分，位于9q34.3 位點，基因全長9850 bp，具有11個外顯子和10 個內含子[6]。BSSL 活性需要被膽鹽激活正是由于外顯子4 編碼由Gly117 至Glu130 間一致序列組成的環狀結構，一旦膽鹽結合后此環便移開，底物便會進入酶活性位點[7]。在沒有膽鹽分子的情況下，有研究表明這種酶具有預先形成的催化位點和功能性氧陰離子孔[8]，這解釋了酶對水溶性酯的活性。

蛋白質結構特點：母乳來源的BSSL 包含722 個氨基酸的單一肽段，含有16 個PEST 重復（重復序列為PVPPPTDSQ）[5]。BSSL 的活性位點是位于435 位組氨酸，320 位天冬氨酸和位于194 位絲氨酸的催化三聯體結構牛磺膽鹽是最有效的激活膽鹽激活脂肪酶的膽鹽[9]。含有1 個N-糖基化位點和9 個O-糖基化位點[10]，這使BSSL 在抗菌抗病毒方面具有重要作用；也正是因為BSSL 的該結構，有學者提出BSSL 在免疫調節方面具有潛在的功能特性。

2 影響BSSL 濃度的因素

影響母乳中BSSL 質量濃度的因素：首先，成熟乳中BSSL 濃度大于初乳（產后0～3 d）中BSSL 濃度，初乳中的BSSL 質量濃度（71.49±40.61）μg/mL[11]。胎齡對母乳中BSSL 的濃度存在影響，有學者研究了并證明了早產兒母親BSSL 濃度略高于足月兒母親[11]。Pamblanco M 等人[12]也認為，胎齡可能會影響BSSL 濃度。因此我們可以認為母乳喂養的早產兒與足月新生兒相比，可能獲得相同或更大的脂肪消化能力，從而改善能量獲取，使早產兒在早期生活中趕上足月嬰幼兒生長發育。其次，孕期肥胖與初乳中BSSL 濃度呈現負相關，這可能是由于母乳中BSSL 濃度受到催乳素的影響，肥胖的母親催乳素水平較低，從而導致了BSSL 分泌的減少。眾所周知，孕期肥胖會增加患有孕期和產后并發癥的幾率，并且對胎兒和新生兒的身體健康產生不良影響[13]。因此，早期營養過剩是肥胖和代謝綜合征的危險因素，不僅會影響自身健康也會對嬰兒的健康產生深遠的影響。妊娠期糖尿病對初乳中BSSL 濃度有顯著影響，患有妊娠期糖尿病的母親初乳中BSSL 濃度較低，由于葡萄糖和胰島素隨著血液循環進入母乳中[14]，母乳中葡萄糖和胰島素水平升高，可能會影響乳腺分泌BSSL。嬰兒的性別不同BSSL 濃度也存在差異，研究表示女嬰則母乳中BSSL 濃度比男嬰高10 μg/mL。最后，隨著泌乳時間的延長，BSSL 濃度會隨之下降，有學者跟蹤測定了產后6 個月的母乳中BSSL 濃度發現，隨著嬰兒的成長，消化系統的成熟，BSSL 濃度逐漸降低且有趨于零的趨勢[15]。

3 不同殺菌方法對BSSL 活性的影響

巴氏殺菌法是一種比較溫和的通過加熱的方式，殺滅生鮮乳中大多數的病原體和腐敗菌[16]。目前大部分人乳庫中都使用巴氏殺菌的方法。人乳在62.5 ℃水浴中加熱30 min，這能使人乳中大腸桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌減少5-10 倍，但這樣的條件會導致乳中活性成分含量減少甚至完全喪失；BSSL 在這種殺菌條件下會完全喪失活性而免疫球蛋白的含量會顯著降低[17]。高壓處理是一種非熱加工處理的方法，是通過對整個樣品快速、均勻的加壓而達到殺菌、延長保質期等目的。高壓處理的方法可以減少營養物質的損失、風味可以得到最好的保證、加工過程中污染低等眾多優點[18]。紫外線照射是一種物理方法，能有效的控制微生物得污染，主要是由于紫外線對微生物的核酸產生光化學危害、對蛋白質也有危害作用從而導致細胞死亡。紫外殺菌具有無化學殘留、殺菌徹底和殺菌用時短等優點[19]。

Koh Jeewon[20]等人通過對比γ-射線，紫外線照射，高壓處理，巴氏殺菌等殺菌技術對人乳中BSSL 活性的影響進行研究，發現巴氏殺菌BSSL 的活性降低99.7%；γ-射線處理后的樣品BSSL 活性比未經處理的母乳相比降低了70.8%；紫外線處理后使樣品中BSSL活性降低64.7%；高壓技術處理后使樣品中BSSL 活性降低了38.4%。Wesolowska[21]等人，研究了高壓處理與巴氏殺菌對母乳中活性成分的影響，發現巴氏滅菌法處理后的母乳脂肪酶活性僅殘留2.1%。相比之下，在450 MPa 15 min 條件下高壓處理后發現，該條件下最大限度地保留了人乳中的脂肪酶。Lukas Christen[22]等人將7 種菌（阪崎氏腸桿菌、屎腸桿菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌和3 種孢子類菌種）接種人乳樣品中，然后用紫外線照射。對未經處理和處理的樣品進行細菌含量、BSSL 活性、堿性磷酸酶活性和脂肪酸譜分析，發現紫外線照射可以將母乳中的細菌含量降低到人乳庫要求的標準，該方法保留了乳中BSSL 的活性并不改變人乳的脂肪酸組成。綜上所述，巴氏殺菌技術幾乎可以使人乳中的BSSL 完全損失，而高壓處理和紫外照射后BSSL 損失相對較少。

4 BSSL 的生物學功能性質

4.1 BSSL 促進脂代謝作用

BSSL 由乳腺分泌并通過乳汁提供給嬰兒，從而彌補內源性脂肪酶的不足[23-24]。剛出生的嬰兒從以葡萄糖為主的能量供應轉變為以脂質為主的能量供應。母乳中的乳脂主要在乳脂肪球中，其核心成分是甘油三脂（95%以上）被三層膜包裹[25]。除了能量，乳脂還提供必需的營養物質，如n-3 和n-6 長鏈多不飽和脂肪酸、磷脂和膽固醇，這些物質對出生后第一年大腦和認知功能的發展非常重要。因此，脂類的有效吸收至關重要，不僅對能量利用，對最佳生長也很重要。母乳來源的BSSL 一旦被小腸上部的內源性膽汁鹽激活，對嬰兒吸收和利用乳脂有顯著的貢獻[26-27]，可以將甘油三酯水解生成甘油和游離的脂肪酸。因此，BSSL 對早產兒的生長及發育具有重要作用。眾所周知，出生后早期生長缺陷可能會對未來的生長、身體健康以及神經系統發育和新陳代謝產生不利影響[28-29]。BSSL 是一種脂肪分解酶，具有廣泛的特異性可水解多種不同的底物，例如甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯、膽固醇酯和視黃酯、磷脂和神經酰胺，可促進食物脂肪消化和吸收。嬰兒脂肪的消化始于胃部的胃脂肪酶，由胃黏膜上主要的酶原細胞分泌。它主要位于胃底和胃體，并水解甘油三酯的sn-3 位。嬰兒胃脂肪酶活性與成人水平相似。乳脂肪膜上的磷脂在胃部不被消化，進入十二指腸后BSSL可以進行催化。在嬰兒早期，十二指腸中的胰腺甘油三酯脂肪酶蛋白含量低，胰腺和乳汁中的BSSL 蛋白是小腸中脂肪消化的主要脂肪酶。

嬰兒在剛出生時，胰腺外分泌功能并未完全發育，BSSL 產物不足以支持適當的脂肪吸收。因此需要通過母乳提供給嬰兒，從而彌補內源性脂肪酶的不足[30-31]。人乳中BSSL 的重要性已在動物模型中得到證明。早在2008年的時候Miller Rita[32]等人進行了動物試驗，喂食給小鼠純化的BSSL，發現BSSL 缺陷型小鼠能正常吸收脂肪，無腸道損害。BSSL 對早產兒的健康生長和發育的重要性已有臨床試驗證明。有報導將人膽汁鹽激活脂肪酶基因在小鼠中表達[33]，轉基因母鼠喂養的早產新生鼠的存活率顯著增高，并且發現通過對照發現，轉基因母鼠喂養的早產鼠體質量增加了43.8%，糞便粗脂肪水平降低了33.3%。Casper Charlotte[34]等人通過臨床試驗研究重組人BSSL 對早產兒生長速度和脂肪吸收的影響，通過對比發現重組人BSSL 治療耐受性良好顯著改善了嬰兒的生長指標和嬰兒對長鏈多不飽和脂肪酸的吸收。綜上所述，BSSL 能夠促進嬰兒對脂肪的消化吸收，并促進生長發育且無腸道損害。

4.2 BSSL 的抗菌抗病毒作用

母乳的各種多功能性成分協同工作，為母乳喂養的嬰兒提供廣泛的即時的防御，提供母乳先天免疫系統的一部分。母乳喂養可以降低新生兒感染疾病的風險，是由于母乳中含有大量外來抗原和宿主因子，它們與母乳喂養嬰兒的食管和腸黏膜相互作用[35]。越來越多的證據表明，母乳可以保護新生兒免受感染，母乳喂養的嬰兒與配方奶粉喂養的嬰兒相比，因腹瀉而導致的發病率和死亡率均有所下降[36-37]。

早在1983年Gillin 就提出了母乳中的脂肪酶可以殺死藍氏賈第鞭毛蟲；不是依賴于分泌性免疫球蛋白A（IgG A）而是與一種不尋常的脂肪酶有關，這種脂肪酶存在于人類的乳中，但不存在于低等哺乳動物的乳中[38]。1985年發現殺死藍氏賈第鞭毛蟲的脂肪酶需要在膽鹽的刺激下才能完成[39]。在1986年研究發現這種脂肪酶就是BSSL，殺死藍氏賈第鞭毛蟲需要人乳中的BSSL 起到間接作用，BSSL 水解甘油三酯后釋放出游離脂肪酸對賈第鞭毛蟲有毒[40]。Naarding 等發現人乳中的BSSL 是一種攜帶Lewis X 的糖蛋白，可以結合樹突細胞上的非整合素分子，抑制HIV 病毒向CD4+T 細胞上轉移[41]。有研究證明了母乳中的巖藻糖基化寡糖能夠保護母乳喂養的兒童免受腹瀉的侵害[42]。Nathalie 等人研究發現[43]含有α1-2 連接巖藻糖的人乳BSSL 可以作為誘餌受體，阻止諾如病毒附著在胃十二指腸組織上，可以起到抑制病毒的效果。綜上所述，BSSL 在抗菌抗病毒方面發揮作用的主要原因，一方面是由于其高豐度的糖基修飾，BSSL 能夠抑制病原微生物黏附在人上皮細胞的受體。另一方面BSSL的水解產物是游離脂肪酸和單酰甘油酯，具有抗菌抗病毒的作用。

5 BSSL 潛在生物學功能特性

5.1 BSSL 對腸道菌群的調節作用

腸道菌群是定植在腸道內的龐大微生物群落[44]。腸道菌群與Ⅱ型糖尿病[45]、心血管疾病[46]、肥胖[47]等疾病都息息相關，因此新生兒腸道菌群的建立影響其未來的身體健康。母乳是調節嬰兒腸道菌群的一個重要的因素，同時也是新生兒營養的最佳來源。嬰兒腸道菌群的形成容易受到分娩方式、胎齡、喂養方式、免疫系統、家庭生活方式、地理位置以及益生菌和抗生素的使用等多種因素的影響[48]。

有研究表示，影響腸道菌群建立的最重要因素是喂養方式的不同，Aifric[49]等人認為純母乳喂養嬰兒與配方奶喂養的嬰兒在腸道微生物群和生長方面存在很大差異。Bezirtzoglou[50]等人使用熒光原位雜交技術對比了母乳喂養和配方奶喂養的嬰兒糞便中的微生物區別，提出采用兩種不同喂養方式的嬰兒，母乳喂養的嬰兒糞便微生物群中的雙歧桿菌細胞數量是配方奶粉喂養的嬰兒的兩倍多。母乳喂養嬰幼兒腸道菌群中雙歧桿菌數量約為99%, 其他常見菌為0.11%～1%[51]。配方奶粉喂養的嬰幼兒，雙歧桿菌占比量大約為40%，腸道菌群種除雙歧桿菌外, 還包括擬桿菌、腸桿菌、腸球菌和梭狀芽孢桿菌等[52]。在分析由與胃腸道相關的所有可用細菌基因組組成的參考基因組時，發現53%的微生物編碼的基因在糖解、蛋白水解和脂肪分解活性方面具有同等的特異性。研究表明，人奶中寡聚糖可以促進雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長，BSSL在初乳中有豐富的寡糖修飾，這些寡聚糖不會被嬰兒消化，主要的作用是調節腸道菌群[53]。因此，我們可以認為嬰兒腸道菌群的建立及成熟的過程中BSSL 發揮潛在的調作用。

5.2 BSSL 的免疫調節作用

新生嬰兒免疫系統尚未發育成熟，容易受到病原微生物及其他有害因素的侵害。在嬰兒免疫調節系統尚未發育完全之前，母乳的攝入十分重要；母乳中含有大量的免疫成分[54]，包括：（1）促進免疫發育的細胞:巨噬細胞、噬中性粒細胞、淋巴細胞；（2）促進免疫發育的成分：細胞因子、長鏈不飽和脂肪酸、核苷、生長因子和其他蛋白；（3）免疫調節因子：抗炎細胞因子、促炎癥細胞因子、其它免疫調節物質。不少學者認為純母乳喂養對新生兒營養狀態及免疫狀態的影響相對更好[55]。也有學者發現，乳脂球膜能提高嬰兒的抵抗力，而BSSL 可以促進乳脂的吸收[56]。雖然，目前并沒有研究證明BSSL 在免疫調節方面的功能，但基于糖基化修飾特點，BSSL 很有可能是免疫調節方面的重要組分。這也將成為BSSL 的下一步研究方向。

6 結束語

現已有大量的實驗以及臨床觀察證實了純母乳喂養的嬰兒可以大大降低感染性疾病的發生危險、降低過敏性疾病的發生、促進生長發育、促進智力發育、促進神經系統發育等眾多益處[57]。母乳中的BSSL 對乳脂的吸收、膽固醇的吸收都有十分重要的作用，對腸道菌群的建立以及免疫調節方面也有潛在的積極影響。而在嬰兒配方奶粉中BSSL 是不存在的，BSSL在巴氏殺菌后也會完全失去活性，因此嬰兒額外的補充BSSL 就變得十分重要。現在已經有研究將BSSL 基因成功的在牛及小鼠中表達。未來將對BSSL 進行更加深入的研究為其以后能夠批量生產并添加到配方奶粉中奠定基礎。