乳中骨橋蛋白的研究進展

張雪丹，王祎，劉宗尚，于景華

（1.天津科技大學食品科學與工程學院 天津 300457；2.上海芝然乳品科技有限公司 上海 201404）

0 引言

骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是一種帶負電荷、高磷酸化和糖基化的蛋白質，等電點為3.6[1-2]。OPN含有一個RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp）序列，最初被鑒定為一種由成骨細胞產生的唾液蛋白[3]。目前OPN 已經被證明存在于乳液、膽汁、尿液等多數細胞和組織中，以分泌型OPN（sOPN） 和細胞內OPN（iOPN） 兩種形式存在[4]。OPN 參與人體多種生理和病理過程，如骨重塑、傷口愈合、免疫調節等[5]。

OPN 在母乳中的平均濃度（138 mg/L）遠高于牛乳（18 mg/L）[6]。但牛乳OPN 與人乳OPN 有61%的序列同源性，都包含相似的整合素結合、蛋白水解和PTM 位點[7]。此外，研究表明補充OPN 可以使配方奶粉喂養的嬰兒在各方面更接近于母乳喂養嬰兒[8]。本文綜述了OPN 的結構、乳中OPN 的質量濃度及其影響因素、分離純化和定量檢測方法，并對OPN 的生物學功能以及OPN 在嬰兒配方奶粉應用及展望作一闡述。

1 OPN 的結構特性

OPN 屬于小整合素結合配體N 端聯結糖蛋白家族，存在于人體人類4 號染色體（4q13）上[1]，由一個基因編碼，合成時分子量約為32 ku，由于選擇性剪接和不同翻譯后修飾，其分子量范圍在41～75 ku[9]。OPN屬于本質無序蛋白，缺乏復雜的二級和三級結構[10]，由314 個氨基酸殘基組成，由于牛乳OPN 缺乏與人OPN 中第188～209 對應的22 個殘基序列，因此牛乳OPN 只含有262 個氨基酸，但與人乳OPN 中298 個氨基酸相比，仍有61%的序列同源性，另外還有44 個殘基保持了很高的結構相似性[11]。此外，OPN 在乳中高度磷酸化，人乳OPN 與牛乳OPN 有部分相同的磷酸化位點以及相同的整合素結合序列[12]，在靠近RGD序列的非磷酸化區域都含有O-糖基化蘇氨酸，但二者之間的聚糖結構存在顯著的差異[13]。

牛乳OPN 和人乳OPN 的分子結構主要包括一個RGD 序列，2 個肝素結合位點，一個凝血酶裂解位點和一個鈣結合位點[14]，如圖1 所示。其中RGD 序列高度保守，具有促進細胞黏附蛋白質的作用，通過與αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α8β1 和α5β1 等整合素結合介導相互作用[15]。OPN 經凝血酶裂解后，暴露出可以與α4β1、α9β1 和α4β7 整合素結合的SVVYGLR 基序，促進細胞黏附[16]。此外，OPN 也是基質金屬蛋白酶3 和7（MMP-3、7）的底物，與凝血酶裂解一樣，碎片化的OPN 表現出增強的刺激細胞黏附和遷移的能力[17]。而鈣結合位點在鈣離子介導或參與的反應過程中發揮著重要作用[18]。OPN 還通過非RGD 結合位點和CD44 相互作用促進黏附和遷移[19]。OPN 含有兩個端區，C 端與CD44 變體相互作用，還包含了兩個肝素結合位點；而N 端包括整合素受體結合區[20]。OPN通過磷酸化、糖基化和蛋白水解處理進行翻譯后修飾導致許多OPN 亞型的存在，目前已經鑒定的包括OPNa（全長亞型）、OPNb（缺少外顯子5）、OPNc（缺少外顯子4）[21]。由不同的細胞類型或者不同條件下表達的OPN 功能不同[22]。

圖1 OPN 的結構特征[15]

2 OPN 的質量濃度及其影響因素

OPN 在大多數組織和體液中表達，但在乳腺中分泌最高質量濃度[23]。乳中OPN 的質量濃度受泌乳階段、地域、物種、季節及疾病等因素的影響會產生變化。

2.1 泌乳階段的影響

乳中OPN 的質量濃度在不同泌乳階段存在差異。初乳中濃度最高，隨泌乳期逐漸下降[23]。對1年哺乳期內母乳OPN 的濃度變化進行研究，發現母乳OPN在初乳（第1～7 d）質量濃度最高，約為178.0 mg/L，第9天時開始下降，并在哺乳一年內持續減少，降低至48.3 mg/L。這種變化可能是由于嬰兒在不同的發育階段需要不同數量的OPN 以滿足不同的功能需求[24]。另一項對牛乳OPN 的研究也得出了相似的結論，結果表明牛初乳中OPN 的質量濃度較高（200 mg/L），在泌乳第5天，下降到低于其初始濃度的10%[25]。

2.2 地域的影響

乳OPN 的質量濃度存在地域差異性。對4 個不同國家母乳樣本中的OPN 濃度進行研究發現，中國母乳中OPN 質量濃度（266.2 mg/L）和OPN 與總蛋白的比例（2.7%）最高；韓國和日本母乳中OPN 質量濃度較低，分別為216.2 mg/L 和185.0 mg/L；而丹麥母乳樣本中的OPN 水平明顯低于其他3 個國家，只有99.7 mg/L。OPN 質量濃度在整個哺乳期都呈下降趨勢，并且在不同國家之間差異顯著，但地域對OPN濃度產生影響的原因還不清楚，可能環境和飲食等差異有關[26]。

2.3 物種、季節和疾病的影響

乳中OPN 的質量濃度也會受到物種、季節以及疾病等因素的影響。對牛、水牛、牦牛、綿羊和山羊奶中的OPN 質量濃度進行測定，證實了不同物種乳中OPN 質量濃度存在差異，其中牦牛乳中OPN 質量濃度最高，為76.8～78.6 mg/L，牛乳中的OPN 質量濃度為51.4～56.4 mg/L，水牛乳中為51.8～68.5 mg/L，綿羊乳、山羊乳中分別為29.8～41.0 mg/L 和12.7～44.3 mg/L[27]。Lu 等[28]的研究結果也表明，除了母乳中存在最高濃度以外，牦牛奶中OPN 的質量濃度較高，分別是牛奶和山羊奶的3.5 倍和5.5 倍左右，且牦牛OPN 與牛OPN 相同，與人OPN 有61%的同源性。對不同季節的牛和水牛中的乳清蛋白進行研究，發現牛乳中OPN 的質量濃度在冬季和夏季無顯著變化；但在水牛乳中，冬季OPN 的質量濃度高于夏季；與冬季的牛乳相比，OPN 在冬季的水牛乳中具有較高的豐度[29]。另外，OPN 的質量濃度也與乳腺疾病相關。研究表明與正常牛乳相比，由金黃色葡萄球菌感染引起的乳腺炎乳中OPN 的表達上調[30]。但另一項研究發現，與健康的荷斯坦牛乳和水牛乳相比，OPN 在患有亞臨床和臨床乳腺炎的牛乳和水牛乳中的質量濃度均較低[31]。

2.4 其他影響因素

最新的研究發現，乳中OPN 質量濃度還與產婦教育程度、產婦年齡以及產次等因素相關[32]。研究者分別在產后1～5 d（初乳）、8～14 d（過渡乳）、1 個月（早成熟乳）和6 個月（成熟乳）收集來自中國3 個地區的母乳樣本，測定了其中主要蛋白質的濃度變化。結果表明，在泌乳前6 個月，乳中總蛋白濃度呈下降趨勢；OPN 質量濃度在初乳中最高（71.8 mg/100 mL），隨著哺乳期逐漸下降；第一次分娩的母親在產后第一個月乳中OPN 質量濃度較高；母親產齡越大、受教育程度越高，其成熟乳中OPN 的質量濃度越高。這一結果可能是由于年齡產生的乳腺的變化，或是飲食上的差異導致蛋白質分泌的差異。而OPN 的質量濃度在這3個地區之間是否存在差異也有待研究。

3 OPN 的檢測方法

3.1 OPN 的分離純化及鑒定

乳中OPN 會通過相互作用力與一些功能蛋白發生結合[33]，因此，乳OPN 的分離純化過程相對復雜，一般是將幾種方法結合來提高蛋白純度。分離純化的方法一般包括離子交換色譜（IEC）、疏水相互作用色譜（HIC）、凝膠過濾、反相色譜（RPLC）以及透析等，其中離子交換法和疏水作用色譜是最常用的方法。離子交換色譜是利用蛋白質在一定條件下所帶電荷的差異，與離子交換劑之間相互作用來實現分離的方法，包括陰離子、陽離子兩種交換劑[34]。OPN 是一種帶負電荷的蛋白質，因此在分離純化過程中多使用陰離子交換色譜柱。而疏水作用色譜作為重要的蛋白質分離純化的方法之一，也廣泛用于OPN 的分離純化，通常與離子交換色譜結合實現更高純度的蛋白分離。

通常純化后OPN 需要進行定性分析，鑒定方法通常包括免疫印跡法和N-末端氨基酸序列分析法。免疫印跡技術是靈敏度、特異性較高的一種蛋白質分離檢測技術，過程包括SDS-PAGE 凝膠電泳分離出蛋白質，然后固定到硝酸纖維素等載體上，利用特異性抗體實現對目標蛋白的檢測[35]。在此過程中可以通過蛋白分子量初步判定是否含有目的蛋白。另外可將目標蛋白質的N-末端氨基酸序列與已知的牛OPN氨基酸序列進行對比實現對目標蛋白的鑒定。

Azuma 等[33]采用兩步陰離子交換色譜法從牛乳清中分離OPN。先通過DEAE - Sephacel 色譜柱在pH 5.0 下分離酸性乳清，第一步色譜得到的OPN 的純度為85%，隨后使用POROSRHQ 陰離子交換柱進行二次色譜，最終從1 L 乳清中提取出約11 mg 純化的OPN。該方法是通過免疫印跡和N-末端氨基酸分析對蛋白進行鑒定，通過SDS-PAGE 檢測到一個分子量約為60 ku 的單個蛋白條帶，其N 端氨基酸序列為LPVKPT，這與已知的牛OPN 相同。

Bayless 等[36]利用離子交換和疏水色譜從牛乳中分離OPN。通過DEAE-Sephacel 柱和phenyl-Hepharose兩個色譜柱后，從1 L 牛乳中得到約8 mg 純化的OPN。SDS-PAGE 顯示蛋白分子量在60 ku 附近，N 端氨基酸序列與已知的牛OPN 一致，鑒定了純化后的蛋白質為OPN。同樣的，LAN 等[37]將陰離子交換色譜和疏水相互作用色譜結合，從1 L 母乳中分離提取出大約9 mg OPN。并通過質譜分析法進行鑒定，發現OPN的蛋白純度大于97%。還有研究先利用離子交換層析技術對OPN 進行第一步分離純化，再經過兩次疏水相互作用，通過透析后凍干得到純化的OPN 組分。將分離產物進行SDS-PAGE 電泳得到分子量約為60 ku，初步判定組分中含有目的蛋白。再通過免疫印跡法進一步鑒定該蛋白為OPN。這種方法得到的OPN 蛋白純度較高，并且更利于保留蛋白活性[38]。

除此疏水作用色譜以外，一些其它的分離純化技術也與陰離子交換技術結合利用。Sorensen 等[39]先通過陰離子交換層析、去除酪蛋白、羥基磷灰石層析和負親和層析這4 個步驟從母乳中分離純化OPN 及其片段，再利用尺寸排除色譜和反相色譜將純化后的OPN 進一步分離成不同的分子形式，并通過SDSPAGE 和氨基酸序列分析對純化的OPN 進行了鑒定。最終從每600 mL 母乳中可以純化大約2 mg 完整的OPN。

目前市場上已經有OPN 成品（Lacprodan OPN-10），是使用陰離子交換法從牛乳清中分離得到的。最終產物中含有約78%的蛋白質，其中95%是OPN，并含有灰分（最多9%）、水分（最多5.5%）以及不到1%的脂肪和乳糖[40]。并且這種方法分離的OPN-10 成品已經過安全性評價證明無遺傳毒性和致畸性作用，耐受性良好，無不良反應[40]。

3.2 OPN 的定量

目前對乳中OPN 定量常用的分析技術有無膠篩分毛細管電泳法（NGSCE）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）和液相色譜法-串聯質譜法（LC-MS/MS）等。

趙京山等[41]利用非涂層毛細管，選用大分子聚乙二醇作為篩分介質，對分離條件進行優化后進行OPN 的測定。經驗證得到OPN 質量濃度在0.079～2.5 g/L 范圍內線性關系良好（R2為0.996），檢出限為0.079 g/L，回收率大于95%，RSD < 5%。結果表明該方法檢測速度快、進樣量小，并且自動化程度高，適于檢測微量蛋白質。無膠篩分毛細管電泳與傳統的凝膠電泳相比，易于填充和沖出，減少蛋白質的吸附和抑制電滲流，并且可以根據實驗目的選擇不同的篩分介質，但在蛋白質實際測定過程中仍然存在如蛋白質吸附、分辨率低及其他復雜成分的干擾等問題[42]。

酶聯免疫法前處理相對簡單，具有高度的特異性和敏感性，不同乳蛋白的交叉反應影響小[43]。OPN 可以通過ELISA 來測定，目前已應用于人乳、牛乳、嬰幼兒配方奶粉[6]及人體血漿[24]中的OPN 定量。雖然ELISA 已經被廣泛應用，但是研究顯示，不同的商業化ELISA 試劑盒測定的濃度存在差異，這可能是由于所使用抗體的交叉反應性、存在翻譯后修飾等因素的影響，造成測定結果存在差異[16]。而且ELISA 耗時長并且成本很高，相比之下高效液相色譜法（HPLC）提供了更高的分辨率，可以實現更快速、可重復的分離，在工業中一般采用HPLC 以降低樣品量和成本[44]。

Farid 等[45]建立了一種反相液相色譜法（RP-HPLC）來量化嬰幼兒配方奶粉中的OPN。結果表明，該方法具有良好的線性（R2=0.999）、靈敏度（檢出限為0.14 mg/L、定量限為0.41 mg/L）、精密度（RSD < 0.2%）以及回收率（99% ～102%），證明該方法能夠簡單、快速、準確的測定嬰幼兒配方奶粉中的OPN。但這種方法可能會受到其它各種蛋白質的干擾。

將液相色譜和質譜結合在一起能夠有效降低樣品分析時的復雜性，可以提供更大的特異性、速度和分析物范圍。由于復雜樣品中蛋白質的理化性質無明顯差異，不易于在液相色譜中實現分離，因此一般利用酶消化目的蛋白，產生更小的肽以利于色譜分離，而且質譜儀對肽比蛋白質更敏感[44]。Faria 等[16]建立了一種使用毛細血管微流LC-MS/MS 系統來量化人體血漿中OPN 的方法并進行驗證。該方法采用免疫純化將OPN 從血漿中分離出來，經過胰蛋白酶消化后獲得的生物學相關特征肽GDSVVYGLR 來進行定量。結果表明在25～600 ng/mL 范圍內具有良好的線性，并具有良好的準確性和精密度。Bei Hu 等[27]利用超高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）對不同種類哺乳動物乳中的OPN 進行定量。該方法中蛋白質經胰蛋白酶消化，選擇OPN 特征肽進行二甲基標記，經純化富集后進行UHPLC-MS/MS 分析。得出方法的檢出限和定量限分別為0.5 mg/L 和2.0 mg/L。線性關系良好（R2≥0.998），回收率為103.7%～111.0%，相對標準偏差為1.8%～6.2%。這種方法測定的牛乳中的OPN 含量（51.4～56.4 mg/L）要遠高于Schack 等[6]用ELISA 法測定的結果（18 mg/L）。造成兩種方法結果差異的原因可能是OPN 的修飾或者裂解可能會影響ELISA 中抗原和抗體之間的結合，也可能是受到牛的品種和泌乳期差異的影響[27]。目前ELISA 是使用較廣泛一種測定，但其測定結果存在多變性，相對而言HPLC- MS/MS 直接對特征肽進行分析，可能會成為更有效的測定方法。

4 OPN 的功能

OPN 通過不同的機制在人體不同部位發揮作用，其生物活性一般是通過與細胞表面受體如CD44和整合素的直接相互作用來實現的[2]，同時sOPN 存在的修飾亞型和iOPN 也使OPN 具有多向活性[3]。OPN在乳中存在的最高含量也說明其在乳中的重要性。

4.1 乳OPN 的功能

有研究表明，乳腺上皮細胞在懷孕和哺乳期過度表達OPN，通過在乳腺上皮中表達OPN 反義RNA的轉基因小鼠，發現OPN 合成的抑制導致了懷孕的小鼠缺乏乳腺肺泡結構，β-酪蛋白和乳清酸性蛋白的合成急劇減少，并且泌乳不足，這表明OPN 參與了乳腺發育和分化[46]。OPN 對乳腺的重要性還體現在OPN 基因（SPP1）的遺傳變異會影響產奶量和局部乳腺免疫[23]。OPN 是高度磷酸化的蛋白質，因此能夠與鈣離子結合并形成可溶性復合物，從而抑制乳中無定形磷酸鈣的沉淀[47]。此外，在乳中OPN 會通過靜電或親和力相互作用與乳鐵蛋白等一些功能蛋白發生結合，并可能作為這些免疫調節或抗菌蛋白到其作用位點的轉運體，并保護它們免受蛋白水解，在作用位點OPN 與這些蛋白可以獨立或可能協同發揮作用[33]。研究表明口服OPN可以抑制DSS 誘導的小鼠結腸炎[48]；同時OPN 也可能通過改變免疫反應來促進病原防御，可以抵御細菌、病毒等感染[7]；可以通過黏附在生物膜中細菌表面來抑制口腔生物膜進一步形成[49]；并通過調節巨噬細胞IL-12和IL-10 細胞因子的差異表達來誘導免疫反應[50]。還有研究表明從牛乳中純化的OPN 在牛體外受精和胚胎發育中起著促進作用[51]。對于OPN 在乳中的生物學作用的相關機制和作用還需進一步研究。

4.2 OPN 的其他功能

OPN 在人體中廣泛存在并通過不同的機制發揮不同的作用。OPN 可以調節骨組織中的生物礦化，在此過程的功能主要包括調節骨細胞黏附、調節破骨細胞功能和調節基質礦化，以此來降低骨折的風險；OPN 可以提高細胞活力，在傷口愈合中也發揮著重要的作用[14]。另外，OPN 可以抑制上皮組織中鈣晶體的生長和聚集，在體內起著關鍵的腎保護作用[52]；也可以防止酒精引起的肝損傷[53]等。然而，研究表明OPN過度表達也存在一些負面影響，例如，OPN 的釋放會增加腫瘤的生長和轉移[54]；OPN 也與心血管疾病有關，如OPN 會增加動脈粥樣硬化斑塊的形成導致動脈鈣化的風險，增加血管阻力，導致心力衰竭等心血管疾病[55]；此外OPN 釋放量增加會誘導產生胰島素抵抗[14]。因此OPN 目前被認為是幾種癌癥的預后和診斷的生物標記之一，通過OPN 水平可以檢測冠狀動脈疾病的存在和嚴重程度，而降低血漿OPN 濃度也可能在預防糖尿病并發癥方面發揮重要作用。

5 應用與展望

近年來的研究表明，OPN 在早期生命發育中發揮重要作用，主要表現在免疫調節、腸道發育及神經系統發育等方面[12]。但在嬰兒配方奶粉中OPN 質量濃度僅有9 mg/L[6]，因此，OPN 的潛在價值在于將其補充到嬰幼兒配方奶粉中，通過模擬母乳成分，給嬰幼兒提供近似于母乳的營養和保護作用。

L.o.nnerdal 等[56]將普通配方奶粉和添加了兩種不同濃度OPN 的配方奶粉（分別添加65 mg/L 和130 mg/L OPN，其中OPN 水平相當于母乳中OPN 濃度的50%或100%）分別喂養嬰兒（1～6 個月），并與母乳喂養嬰兒進行比較。結果表明，與食用普通配方奶粉的嬰兒相比，食用添加OPN 的配方奶粉的嬰兒血清中促炎細胞因子TNF-a 的濃度顯著降低；嬰兒的患病天數明顯減少；并且食用補充100%OPN 配方奶粉的嬰兒血漿蘇氨酸及支鏈氨基酸明顯較低。結果說明OPN 參與調節了嬰兒的免疫功能，使配方奶粉喂養的嬰兒與母乳喂養的嬰兒更相似。同樣的，研究發現，母乳喂養嬰兒和補充OPN 的配方奶粉喂養的嬰兒，在4 個月和6 個月時血漿樣本中OPN 水平要高于喂養常規配方奶粉嬰兒，表明在嬰兒配方奶粉中補充OPN 可能是通過增加內源性OPN 合成發揮其有益功能[24]。

對牛乳OPN 進行體外消化研究證明，含有整合素結合基序的生物活性OPN 片段能夠抵抗胃消化，在到達體內腸道后存活下來，并通過整合素信號在腸道內發揮多效性功能[57]。因此，部分研究利用動物模型探討補充OPN 的配方奶粉對嬰幼兒腸道發育的影響。對新生恒河猴分別給予母乳、普通配方奶粉和添加了質量濃度125 mg/L OPN 配方奶粉喂養3 個月，提取空腸mRNA 并進行微陣列分析。結果發現普通配方奶粉喂養和母乳喂養的幼猴腸道中的基因表達存在差異，在配方中補充了OPN 后改變了這種差異表，使喂養OPN 配方組的空腸轉錄組基因與母乳喂養更加相似，而且不會對新生兒的生長產生不利影響[8]。這說明補充OPN 可以通過整合素誘導腸道基因表達，促進新生兒腸道健康。Ren 等[58]對早產的仔豬注射LPS，并連續5 d喂食補充OPN（質量濃度30 g/L）的配方奶粉，與普通配方相比，補充OPN 后降低了腹瀉率，并刺激了腸上皮細胞的增殖，對早產仔豬的未成熟腸道發揮了適度的保護作用。這些結果都表明OPN 可以在嬰幼兒腸道中直接發揮作用，與SU 等人[59]的研究結果一致，在經過胃腸道消化后的母乳和嬰兒配方奶粉中都發現的一種來自OPN 的多肽。

因此，OPN 作為一種多功能蛋白質，將其添加至配方奶粉中可以促進嬰幼兒的免疫保護和腸道發育，減小配方奶粉喂養與母乳喂養的嬰兒之間的差異。除此以外，有研究表明OPN 在嬰兒早期的腦發育、學習和記憶功能中發揮著積極的作用[60]。這是通過小鼠口服乳OPN 得到的結果，但也表明了在配方奶粉中補充OPN 另一個可能的潛在益處。而且除了單獨發揮作用外，OPN 在乳中會與乳鐵蛋白（LF）相互結合形成LFOPN 復合物，其體外消化的穩定性和對腸細胞增殖和分化的促進作用高于單個蛋白質，并能更有效地被腸道上皮細胞結合和吸收，并增強它們各自的生物活性[37]。這種生物活性表明若將OPN 以復合物形式加入嬰兒配方奶粉中，可能比單個OPN 發揮更好的功效。

目前對OPN 在嬰幼兒配方奶粉中的應用研究還較少，但離子交換色譜已經應用于牛乳OPN 的分離純化，并且成品已被證明安全無毒性。酶聯免疫法和液相色譜-質譜聯用可能成為更廣泛使用的含量測定的方法。此外，牦牛乳中含有較高濃度的OPN，這也可能作為母乳OPN 的另一個替代來源。補充OPN可以使配方奶粉具有更接近母乳的功能，同時，OPN與乳中其它成分之間協同可能會發揮更好的作用。然而對于乳OPN 的更多的功能、作用機制及其添加到嬰幼兒配方奶粉中的安全性未來還需進一步研究。