基于HPLC-MS/MS 的羊乳寡糖GP 衍生化條件優化

張曦美，王海燕，王爽爽，李璐，杜管利，馬宏祥，葛武鵬

（1. 西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2. 富平縣檢驗檢測中心 陜西省羊乳產品質量監督檢驗中心，陜西 富平 711700；3. 陜西秦龍乳業集團有限公司，西安 710000；4. 陜西紅星美羚乳業股份有限公司，陜西 富平 711700）

0 引言

寡糖（Milk oligosaccharides, MOs）是由3～15 個單糖通過糖苷鍵連接而形成的直鏈或支鏈的低聚合體，主要由葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、巖藻糖（Fuc）、N-乙酰神經氨酸（唾液酸，NeuAc）、N-羥乙酰神經氨酸（NeuGc）6 種單糖組成[1-3]。研究表明，MOs 可作為益生元影響腸道微生物群的組成，特別是雙歧桿菌和乳酸桿菌，可改善機體健康或作為抗黏附抗菌劑阻止病毒、細菌或其他病原體與腸上皮細胞結合，改變宿主上皮細胞和免疫細胞反應，發揮免疫調節作用[4-6]。與牛乳和綿羊乳相比，山羊乳寡糖（Goat milk oligosaccharides，GMOs） 組成與人乳更相似，GMOs 含量在0.25～0.3 g/L，約為牛乳寡糖含量的4 倍，綿羊乳寡糖含量的10 倍[7-8]，目前已鑒定70 多種GMOs，其種類多樣性雖低于人乳但顯著高于牛乳[9]。山羊乳可以作為嬰幼兒寡糖的天然來源[10]，因此明確GMOs 結構組成對于GMOs 的開發與利用具有重要意義。

近年來，高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS/MS）技術被廣泛應用于寡糖分析[11]。Lu 等[12]利用LCMS/MS 測定了關中和薩能奶山羊的GMOs 結構和含量，成功鑒定出64 種羊乳中寡糖，其中關中山羊奶6'-唾液酰乳糖的含量是薩能山羊奶的3.3 倍；Meyrand 等[13]利用質譜鑒定對比了人乳寡糖與GMOs 的結構差異，人乳中的復合巖藻糖基化唾液酸化寡糖在羊乳中較少存在，而GMOs 中包含人乳中不合成的N-羥乙酰神經氨酸單體。同時，為了提高質譜檢測靈敏度，在質譜測定中多種化學衍生化方法被用來提高聚糖檢測靈敏度，包括羥基衍生化（甲基化、乙酰化）、還原端衍生化（還原胺化反應、羥基縮合反應）等[14-15]。在糖類的質譜測定中，還原端衍生化應用廣泛，還原胺化反應需除去過量試劑，而羥基縮合反應中不加入或生成鹽類，可直接用質譜進行檢測，減少樣品損耗，羥基縮合反應中吉拉德試劑P（Girard's reagent P，GP），即1-（2-肼基-2-氧乙基）吡啶翁氯化物，以陽離子標簽的形式作為MS檢測增強劑，與糖鏈衍生后，在質譜檢測中只表現出正離子峰，僅檢測到[M]+離子，避免了[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+等多個離子加合物[16-17]，可簡化質譜數據解釋，提高檢測靈敏度。此外，帶正電荷的標簽可以提高標記聚糖的電離效率，增強MS 分析中聚糖的檢測靈敏度[18]。Lu 等[19-20]利用GP 試劑衍生化人乳及羊乳寡糖，提高人乳及羊乳寡糖的質譜檢測效率，測定了不同泌乳階段母乳及羊乳N/O-糖鏈變化。衍生化過程中，衍生化條件是衍生化效率的重要影響因素，影響寡糖的定量分析，然而衍生化條件對寡糖衍生化效率的影響鮮有報道。

因此，本研究以2'- FL 寡糖單體比較不同質量濃度或不同體積的GP 溶液對寡糖衍生化效率的差異，探究不同GP 衍生化條件對GMOs 衍生效率的影響，得到最優衍生化條件，為羊乳寡糖的檢測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與裝置

LTQXL 高效液相色譜-質譜聯用儀，美國賽默飛爾公司產品；高速離心機，安徽中科中佳公司產品；LGJ-25C 真空冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠有限公司產品；V-800 旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI 有限公司產品。

1.2 材料與試劑

2'-FL（生物試劑），上海糖門生物科技有限公司產品；水蘇糖（生物試劑），上海源葉生物科技有限公司產品；Girard's Reagent P（分析純），上海源葉生物科技有限公司產品；乙腈（色譜純），Sigma Aldrich 公司產品；甲醇（色譜純），Sigma Aldrich 公司產品；冰醋酸（分析純），成都市科隆化學品有限公司產品；無水乙醇（分析純），成都市科隆化學品有限公司產品；山羊乳，采集自西北農林科技大學克隆羊基地的薩能奶山羊。

1.3 試驗方法

1.3.1 GMOs 制備

羊乳于4 ℃下13000g 離心30 min，取中間層（棄上層脂肪和下層蛋白），與兩倍體積的無水乙醇混合，4 ℃過夜，4 ℃下10000g 離心15 min，收集上層清液，濃縮后凍干，得到寡糖粗品。通過石墨化碳固相萃取柱（500 mg/3 mL）純化寡糖粗品，3 mL 乙腈、3 mL 超純水活化和平衡石墨化碳固相萃取柱，羊乳寡糖粗品上樣后，以10 mL 超純水洗柱除鹽及乳糖，最后用3 mL 25%乙腈和3 mL 含0.05%TFA 的25%乙腈洗脫，合并洗脫液后旋蒸濃縮凍干，得到GMOs。

1.3.2 GP 溶液配制

稱取1.87 g Girard’s reagent P 溶于100 mL 水/甲醇/冰醋酸6∶3∶1（體積比）溶液，配置成濃度為0.1 mol/L的GP 溶液。以相同的方法分別配制濃度為0.01 mol/L和0.2 mol/L 的GP 溶液。

1.3.3 樣品衍生化

稱取50 mg 2'-FL，分別加入1 mL 0、0.01、0.1、0.2 mol/L GP 溶液；稱取50 mg 2'-FL 或GMOs，分別加入0.2、1.0、5.0、10.0 mL 0.1 mol/L GP 溶液（以不加GP 溶液為對照），室溫振蕩30 min，凍干待用。稱取0.30 mg 衍生后樣品，將樣品溶于1 mL 50%的乙腈溶液中，過0.22 μm有機濾膜注入色譜瓶中，上機檢測。

1.4 試驗條件

1.4.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH Amide 色譜柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫45 ℃；流速0.3 mL/min；2'-FL 進樣量5 μL；GMOs 進樣量15 μL。洗脫條件：流動相：A 為含0.5%氫氧化銨的50%乙腈水溶液，B 為100%乙腈，洗脫程序：0～60 min，45%A，55%B。

1.4.2 ESI-MS/MS 條件

電噴霧離子源（ESI），電噴霧電壓5000 V；離子源溫度（TEM）550 ℃；離子輸運毛細管溫度370 ℃；毛細管電壓4700 V；管透鏡電壓250 V；鞘氣體流量30.0 arb；輔助氣體流量4.0 arb；離子波及氣體流量0 arb。在正離子模式下200～2000 m/z 進行一級離子掃描，50～2000 m/z進行二級離子掃描。

1.5 數據處理

數據由Xcalibur 軟件（Thermo Scientific）獲得，通過Glycoworkbench 軟件在一級質譜的質量誤差小于1×10-5進行HMOs 匹配查找，并利用Glycoworkbench軟件模擬HMOs 二級碎片結構進行比對，采用Origin 2019 軟件繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 2'-FL 的GP 衍生化效率

2.1.1 GP 衍生化原理

吉拉德試劑標記糖鏈的原理屬于腙化反應[21]，如圖1 所示，利用還原性糖的還原末端與試劑的酰肼基反應，形成穩定的腙，因此反應不需要還原，可減少還原后的純化過程中樣品的損失。吉拉德試劑衍生試劑因自身帶有正電荷，衍生后使被測物質也帶有永久正電荷，在質譜檢測時主要形成[M]+離子，避免了其它衍生試劑在質譜檢測中隨機出現的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+等多種金屬加合離子峰并存的現象，檢測靈敏度提高的同時，使質譜分析變得簡單清晰，便于計算。同時樣品處理方法簡單，無需復雜的除鹽步驟，避免了由樣品損失率不同而引起定量誤差的可能，提高了檢測方法的準確度[22]。

圖1 糖類物質與GP 衍生化反應原理[24]

2.1.2 2'-FL 與不同質量濃度GP 溶液的衍生化效率

2'-FL 與不同質量濃度GP 溶液衍生化后的提取離子流圖如圖2 所示，2'-FL 的保留時間在2.4 min 左右，分子量為506.17。衍生化后的2'-FL 保留時間在11.35 min左右，分子量為622.17。2'-FL 原型和衍生產物的峰面積如表1 所示，隨著GP 溶液質量濃度升高，2'-FL 原型逐漸減少，越來越多的2'-FL 被GP 試劑衍生化，GP 衍生化的效率隨著GP 溶液的質量濃度的增加不斷升高，在濃度大于0.1 mol/L 時衍生化效率可達95%以上，說明GP 溶液對寡糖的衍生化效率受GP 溶液質量濃度的影響。2'-FL 衍生化后的峰面積明顯高于未衍生化的2'-FL 寡糖單體原型，說明GP 可以提高寡糖檢測的靈敏度。

表1 2'-FL 與不同質量濃度GP 溶液的衍生化效率

圖2 不同衍生化條件下2'-FL 寡糖單體提取離子流圖

2.1.3 2'-FL 與不同體積GP 溶液的衍生化效率

根據不同質量濃度GP 衍生化效率選擇0.1 mol/L GP 溶液，進一步探究相同質量濃度下不同GP 溶液體積對GP 衍生化的影響。2'-FL 中加入不同體積0.1 mol/L GP 溶液進行衍生化，得到提取離子流圖如圖3 所示，2'-FL 的保留時間在2.2 min 左右，分子量為506.17，衍生化后的2'-FL 保留時間在14.6 min 左右，分子量為622.17。2'-FL 原型和衍生產物的峰面積如表2 所示，得到的衍生化效率結果與質量濃度相同，隨著GP 溶液體積的增加，2'-FL 原型逐漸減少，說明越來越多的2'-FL 被GP 試劑衍生化。GP 衍生化的效率隨著加入GP 溶液體積的增加不斷升高，在加入1 mL GP 試劑后衍生化效率為94.1%，大于5 mL 的GP 試劑衍生化效率可達99%以上。

表2 2'-FL 與不同體積GP 衍生化效率

圖3 不同衍生化條件下2'-FL 寡糖單體提取離子流圖

2.2 GMOs 的GP 衍生化效率

通過比較不同濃度及不同體積的GP 溶液對2’-FL 的衍生化效率，可以發現優化衍生化試劑體積比質量濃度可得到更高的衍生化效率，因此在后續對羊乳寡糖混合物衍生化效率的探究中，固定衍生化試劑的質量濃度，得到最優衍生試劑體積，并以其中含量較高的6種羊乳寡糖的衍生化效率為例。不同體積0.1 mol/L GP 溶 液 對 6 種 羊 乳 寡 糖（H1N1F1、H2N1、H4、H1N2、H3N1、H5）的衍生化效率如表3 所示，通過峰面積可以得出與2’-FL GP 衍生化效率相同的結論，隨著0.1 mol/L GP 溶液體積的增加，GMOs 原型不斷減少，GMOs 衍生化產物增加。相同體積的0.1 mol/L GP 溶液下，H1N2 的衍生化效率最高，H4 的衍生化效率最低，這可能與其結構、含量有關，但在0.1 mol/L GP 溶液體積大于1 mL 時，二者的衍生化效率均可大于90 %。加入1 mL 的0.1 mol/L GP 溶液時，6 種GMOs 的衍生化效率在95%左右，加入5 mL 的0.1 mol/L GP 溶液時，6 種GMOs 的衍生化效率均在99%左右，加入10 mL 的0.1 mol/L GP 溶液時，6 種GMOs 的衍生化效率同樣可達99%以上，說明隨著體積的增大，GP 溶液對GMOs 的衍生化效率逐漸升高至接近100%，并保持穩定。

表3 GMOs 衍生化效率

2.3 討論

Yu 等[20]使用10 μL 1mol/L GP 試劑優化了羊乳N-寡糖鏈結構判定的方法，Zhang 等[23]通過組織上GP衍生化結合MALDI-MSI，實現癌癥組織樣本中N-聚糖的高度敏感空間特征，不同文獻中GP 衍生化條件存在差異，而其中的GP 衍生化效率未見詳細討論。通過本實驗可以得到吉拉德試劑P 對人乳和羊乳具有相同的衍生化功能，衍生物均可通過HPLC-MS/MS 進行分離和分析，提高寡糖檢測靈敏度，用于乳寡糖的結構和功能分析。吳智宇[24]建立了一種基于吉拉德試劑P 衍生化的d0/d5 穩定同位素標記電噴霧電離質譜相對定量分析還原性寡糖鏈的方法，在確定衍生化反應溫度和反應時間的基礎上，分別對Lac/GP摩爾比為1∶1、1∶1.5 和1∶2 條件下的衍生化產物進行了質譜檢測，摩爾比為1∶1 和1∶1.5 時，反應不完全，摩爾比為1∶2 時，反應完全。此外，對吉拉德試劑對于質譜靈敏度的提高能力進行了考察，結果表明試劑可將被測物的檢測靈敏度提高8 倍，與本研究結論相似，隨著GP 溶液質量濃度的增加，寡糖的衍生化效率提高。摩爾質量是影響衍生化效率的重要因素，在相同摩爾質量下，溶液體積過少會導致衍生化反應不完全。在寡糖的提取過程中，同一反應溫度和反應時間的基礎上，利用足量的GP 試劑與寡糖完全反應是提高寡糖檢測靈敏度的一種重要方式。

3 結論

本研究采用高效液相色譜-質譜聯用技術分析了相同體積不同質量濃度及不同體積相同質量濃度下的GP 溶液對2’-FL 及GMOs 衍生效率的影響。結果表明，在2’-FL 衍生化過程中，GP 質量濃度和體積的增加可以提高寡糖的衍生化效率，隨著GP 溶液質量濃度和體積的增加，寡糖原型顯著減少，在加入0.1 mol/L的GP 溶液5 mL 時，寡糖的衍生化效率可達到99%以上。在6 種羊乳寡糖的質譜分析中可以得到相同的結果。由于GP 試劑使寡糖只顯示了[M]+離子，減少了[M+Na]+和[M+K]+離子的干擾，為羊乳寡糖結構的鑒別和區分提供了便利，但在寡糖的衍生化過程中，相同的反應條件下，應考慮GP 溶液的質量濃度及體積的影響，實現寡糖完全衍生化，避免寡糖原型與衍生化產物同時大量存在，使得寡糖的定量分析更加精準。